本发明专利技术公开了一种靶向环状RNA的shRNA，其特征在于，所述环状RNA为环状RNA hsa_circ_0005571，所述shRNA包含正义链、反义链、茎环结构以及终止信号。本发明专利技术还公开了上述shRNA的慢病毒表达载体及其构建方法。本发明专利技术的靶向环状RNA hsa_circ_0005571的shRNA，通过转染shRNA可下调hsa_circ_0005571的表达，显著抑制癌细胞活性，为宫颈癌相关circRNA的临床治疗和科学研究提供了基础。疗和科学研究提供了基础。疗和科学研究提供了基础。
【技术实现步骤摘要】
一种靶向环状RNA的shRNA、慢病毒表达载体及其构建方法和应用
[0001]本专利技术属于基因工程
，具体而言，涉及一种靶向环状RNA的shRNA、慢病毒表达载体及其构建方法和应用。
技术介绍
[0002]作为最常见的妇科恶性肿瘤之一，宫颈癌已成为一种重要的公共卫生问题。近年来，随着人乳头瘤病毒(HPV)疫苗的使用与宫颈癌筛查的普及，宫颈癌发病率在西方发达国家明显下降，而我国宫颈癌的发病率却有升高趋势。根据目前宫颈癌的最新发病报告来看，全球最新的发病例数大约是60万/年，死亡例数大约34万/年。中国的每年新发病例数接近11万，死亡人数大概在5.9万，中国宫颈癌的发病率大约占全球的1/5，宫颈癌仍是严重危害女性健康的疾病。在加强宫颈癌预防同时，宫颈治疗仍然面临巨大挑战。目前，手术、放化疗是宫颈癌的主要治疗手段，但对于大多数晚期宫颈癌患者的疗效并不理想，晚期复发性宫颈癌预后较差，仍缺乏有效的治疗方法。因此，进一步探究宫颈癌的发病机制，探索新的宫颈癌治疗方法迫在眉睫。
[0003]环状RNA(circularRNAs，circRNAs)是一类由前体mRNA(pre
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mRNA)反向剪接形成的单链闭合环状RNA分子。目前研究已证实多种circRNAs在宫颈癌细胞中差异表达，通过竞争结合微小RNA(miRNA)以发挥海绵吸附作用，与RNA结合蛋白相互作用，甚至翻译功能肽等方式，广泛参与肿瘤细胞生长、侵袭、迁移和转移等。但总体而言，对于circRNAs在宫颈癌中的研究尚处于起步阶段，其详细分子作用机制尚未完全阐明，对circRNAs能否作为宫颈癌治疗靶标等方面存在较大研究空间。
[0004]环状RNA hsa_circ_0005571，定位于人类第19号染色体(18285849
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18286507)，起源于其线性亲本基因IFI30第1
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3号外显子。当前关于hsa_circ_0005571的报道较少，仅一项研究提示hsa_circ_0005571可能参与调控三阴性乳腺癌细胞的增殖、侵袭、迁移、和凋亡等恶性生物学过程(PMID:35378000)。而对于hsa_circ_0005571在宫颈癌中的功能尚无研究报道，与宫颈癌发生发展是否存在相关性尚不可知。
技术实现思路
[0005]针对上述问题，本专利技术目的在于提供一种靶向环状RNA hsa_circ_0005571的shRNA和应用，该环状RNA与宫颈癌细胞增殖能力相关，针对其设计的shRNA可应用于抗宫颈癌药物的制备。
[0006]本专利技术的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
[0007]本专利技术的一个方面提供了一种靶向环状RNA的shRNA，所述环状RNA为环状RNA hsa_circ_0005571，所述shRNA包含正义链、反义链、茎环结构以及终止信号；
[0008]所述正义链具有如序列表SEQ.ID.No.2所示的碱基序列，所述反义链具有如序列表SEQ.ID.No.3所示的碱基序列；
[0009]所述茎环结构的碱基序列为CTCGAG；
[0010]所述终止信号的碱基序列为TTTTT或TTTTTT。
[0011]本专利技术的另一个方面还提供了一种靶向环状RNA的shRNA的慢病毒表达载体，其特征在于，该载体是：pLKO.1
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puro
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hsa_circ_0005571
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shRNA慢病毒载体。
[0012]本专利技术的又一个方面还提供了一种靶向环状RNA的shRNA的慢病毒表达载体的构建方法，所述慢病毒表达载体由合成的所述shRNA克隆入慢病毒表达载体pLKO.1
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puro中而得，所述的构建方法包括以下步骤：
[0013](1)设计shRNA靶点：其具有如序列表SEQ.ID.No.1所示的碱基序列；
[0014](2)DNA oligo序列合成：根据所述shRNA靶点设计shRNA干扰序列，其正义链具有如序列表SEQ.ID.No.2所示的碱基序列，所述反义链具有如序列表SEQ.ID.No.3所示的碱基序列；
[0015](3)DNA oligo序列退火：将正义链和反义链混匀然后加入退火缓冲液进行退火，形成shRNA模板，然后稀释备用；
[0016](4)载体线性化：将慢病毒表达载体pLKO.1
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puro于37℃进行双酶切反应3h，对产物进行电泳，回收线性化pLKO.1
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puro，稀释备用；
[0017](5)目的片段与载体连接：将得到的线性化pLKO.1
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puro与得到的shRNA模板于16℃连接过夜得到连接产物；
[0018](6)转化及阳性克隆的PCR鉴定与测序：将连接产物加入到大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴2min；加入无抗生素的LB液体培养基培养；取菌液均匀涂抹在含有Amp的LB固体培养基上，于37℃培养箱中过夜培养，次日，挑取单菌落，进行菌液PCR鉴定，挑选阳性克隆进行测序，鉴定阳性克隆即为构建成功的pLKO.1
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puro
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hsa_circ_0005571
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shRNA慢病毒载体。
[0019]进一步地，步骤(2)中所述shRNA干扰序列中还包含碱基序列为CTCGAG的茎环结构，以及碱基序列为TTTTT或TTTTTT的终止信号。
[0020]进一步地，步骤(3)中所述正义链和反义链的浓度比为1:1。
[0021]进一步地，步骤(3)中所述退火程序为：95℃，30s；72℃，2min；37℃，2min；25℃，2min。
[0022]进一步地，步骤(4)中所述双酶切反应中使用的酶为AgeI/EcoRI，酶切体系为：
[0023][0024]进一步地，步骤(5)中所述连接体系为：
[0025][0026]本专利技术的再一个方面还提供了一种靶向环状RNA的shRNA在制备抗宫颈癌药物中的应用。
[0027]本专利技术的再一个方面还提供了一种靶向环状RNA的shRNA的慢病毒表达载体在制备抗宫颈癌药物中的应用。
[0028]本专利技术与现有技术相比具有明显的优点和有益效果：本专利技术所公开的一种靶向环状RNA hsa_circ_0005571的shRNA，通过转染shRNA可下调hsa_circ_0005571的表达，显著抑制癌细胞活性，为宫颈癌相关circRNA的临床治疗和科学研究提供了基础。
[0029]上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本专利技术的较佳实施例并结合附图详细说明如后。
附图说明
[0030]图1为慢病毒介导的shRNA对宫颈癌细胞中hsa_circ_0005571基因抑制效果；
[0031]图2为利用CCK8检测干扰hsa_c本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种靶向环状RNA的shRNA，其特征在于，所述环状RNA为环状RNA hsa_circ_0005571，所述shRNA包含正义链、反义链、茎环结构以及终止信号；所述正义链具有如序列表SEQ.ID.No.2所示的碱基序列，所述反义链具有如序列表SEQ.ID.No.3所示的碱基序列；所述茎环结构的碱基序列为CTCGAG；所述终止信号的碱基序列为TTTTT或TTTTTT。2.根据权利要求1所述的靶向环状RNA的shRNA的慢病毒表达载体，其特征在于，该载体是：pLKO.1
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puro
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hsa_circ_0005571
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shRNA慢病毒载体。3.根据权利要求2所述的靶向环状RNA的shRNA的慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于，所述慢病毒表达载体由合成的所述shRNA克隆入慢病毒表达载体pLKO.1
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puro中而得，所述的构建方法包括以下步骤：(1)设计shRNA靶点：其具有如序列表SEQ.ID.No.1所示的碱基序列；(2)DNA oligo序列合成：根据所述shRNA靶点设计shRNA干扰序列，其正义链具有如序列表SEQ.ID.No.2所示的碱基序列，所述反义链具有如序列表SEQ.ID.No.3所示的碱基序列；(3)DNA oligo序列退火：将正义链和反义链混匀然后加入退火缓冲液进行退火，形成shRNA模板，然后稀释备用；(4)载体线性化：将慢病毒表达载体pLKO.1
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puro于37℃进行双酶切反应3h，对产物进行电泳，回收线性化pLKO.1
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puro，稀释备用；(5)目的片段与载体连接：将得到的线性化pLKO.1
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puro与得到的shRNA模板于16℃连...
【专利技术属性】
技术研发人员：袁奕，高凡雅，范许云，何胜祥，
申请(专利权)人：安徽同科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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