LncRNAKIFAP3-5:1在制备糖尿病肾病防治药物中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种LncRNA KIFAP3

【技术实现步骤摘要】
KIFAP3
‑
5:1过表达慢病毒。
[0011]本专利技术还提供LncRNA KIFAP3
‑
5:1过表达慢病毒在制备糖尿病肾病防治药物中的应用。
[0012]在一种优选方案中，本专利技术提及的LncRNA KIFAP3
‑
5:1过表达慢病毒(rLV
‑
EF1a
‑
lncRNA(LOC102552829
‑
201)
‑
bGH polyA
‑
CMV
‑
mCherry
‑
hGH polyA，简称为LV
‑
LncRNA KIFAP3
‑
5:1)，制备方法包括如下步骤：
[0013]1)质粒构建：
①
载体线性化：以GV492为骨架(pCMV
‑
Ubi
‑
MCS
‑
3FLAG
‑
CBh
‑
gcG FP
‑
IRES
‑
puromycin)，采用BamHI和AgeI酶切，获得线性化的载体片段。
②
目的片段获取：用BamHI/AgeI酶切化学合成的含有目的基因的质粒，获得目的基因LncRNA KI FAP3
‑
5:1序列，PCR扩增目的基因片段。
③
骨架和目的基因连接：将线性化载体与片段混合，在T4连接酶作用下，实现片段与载体的连接。
>④
转化大肠杆菌Trans1
‑
T1，挑取单克隆，并通过PCR检测、酶切和测序鉴定出阳性克隆。
[0014]2)将构建好的病毒载体和病毒包装辅助质粒(Helper 1.0)和病毒包装辅助质粒(Helper2.0)共转染293T包装细胞中，包装慢病毒，扩增收集病毒，采用超速离心的浓缩纯合发生得到高浓度的慢病毒保存液，测定病毒滴度；将空载体和慢病毒载体按照上述步骤共转染293T细胞，包装阴性对照慢病毒。
[0015]本专利技术通过基因芯片筛选及qRT
‑
PCR验证。结果发现：LncRNA KIFAP3
‑
5:1在糖尿病肾病患者血浆中的表达明显降低，表明LncRNA KIFAP3
‑
5:1下调与DN的形成有关。进一步地，体外实验，在人源和鼠源肾小管上皮细胞转染LncRNA KIFAP3
‑
5:1敲低病毒，结果发现：下调LncRNA KIFAP3
‑
5:1诱导肾小管EMT过程。而在肾小管上皮细胞过表达LncRNA KIFAP3
‑
5:1后，结果发现：过表达LncRNA KIFAP3
‑
5:1可改善EMT过程。从而从正反两方面明确LncRNA KIFAP3
‑
5:1在DN肾小管细胞EMT过程中的作用，接下来，构建糖尿病肾病小鼠模型进一步证实了LncRNA KIFAP3
‑
5:1可以改善肾间质纤维化和肾小管EMT，为DN防治药物的研发提供了新的思路。
[0016]本专利技术还提供一种药物组合物，该药物组合物以上述LncRNA KIFAP3
‑
5:1过表达慢病毒为活性成分或主要活性成分，辅以药学上可接受的载体。该药物组合物可以为固体制剂或液体制剂，特别是注射剂、口服液、颗粒剂、粉剂、片剂或胶囊剂。药学上可接受的辅料在整个制剂技术发展过程中起到关键的作用，许多制剂中辅料占到大部分，因而很大程度上辅料的性质决定了制剂的性质。优良的辅料可以增强主药的稳定性，延长药剂的有效期；可以调控主药在体内外的释放速度；可以改变药物在体内的吸收，增加生物利用度，对具体的辅料类型不作限定。
[0017]采用本专利技术的技术方案，优势如下:
[0018]本专利技术证实了LncRNA KIFAP3
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5:1在DN肾小管细胞EMT中的重要作用，而上调LncRNA KIFAP3
‑
5:1可明显改善肾小管EMT。因此，LncRNA KIFAP3
‑
5:1可以作为分子靶点用于制备防治DN的药物，为DN防治药物的研发提供了新的思路。
附图说明
[0019]图1是N组、T2DM组和DN组患者血浆样本LncRNA KIFAP3
‑
5:1的表达情况；
[0020]图2是高糖诱导的肾小管上皮细胞中LncRNA KIFAP3
‑
5:1的表达变化；其中，图2中
(A)为hRPTECs细胞中LncRNA KIFAP3
‑
5:1的表达；图2中(B)为mRTEC细胞中LncRNA KIFAP3
‑
5:1的表达；
[0021]图3是LncRNA KIFAP3
‑
5:1稳定过表达和敲低的验证；其中，图3中(A)和(B)为hRPTECs细胞中LncRNA KIFAP3
‑
5:1的表达情况；图3中(C)和(D)为mRTEC细胞中LncRNA KIFAP3
‑
5:1的表达情况；
[0022]图4是正常糖培养时敲低KIFAP3
‑
5:1对hRPTECs细胞和mRTEC细胞EMT的影响；其中，图4中(A)为hRPTECs细胞中EMT相关蛋白的表达；图4中(B)为EMT相关蛋白的统计结果；图4中(C)为mRTCE细胞中EMT相关蛋白的表达；图4中(D)为EMT相关蛋白的统计结果；
[0023]图5是高糖培养时过表达KIFAP3
‑
5:1对hRPTECs细胞和mRTEC细胞EMT的影响；其中，图5中(A)为hRPTECs细胞中EMT相关蛋白的表达；图5中(B)为EMT相关蛋白的统计结果；图5中(C)为mRTCE细胞中EMT相关蛋白的表达；图5中(D)为EMT相关蛋白的统计结果；
[0024]图6是过表达KIFAP3
‑
5:1对糖尿病小鼠肾功能指标的影响；其中，图6中(A)为各组小鼠BUN水平统计结果；图6中(B)为各组小鼠UP水平统计结果；图6中(C)为各组小鼠mAlb水平统计结果；图6中(D)为各组小鼠β2
‑
MG水平统计结果；图6中(E)为各组小鼠NAG水平统计结果；数据以Mean
±
SEM表示，n＝6；
*
P<0.05，
**
P<0.01，与db/m组相比；
#
P<0.05，
##
P<0.01，与db/db+LV
‑
Control组相比；
[0025]图7是过表达KIFAP3
‑
5:1对糖尿病小鼠肾间质纤维化及肾脏EMT的影响；图7中(A)各组小鼠EMT相关蛋白的表达情况；图7中(B)为各组小鼠本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.LncRNA KIFAP3
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5:1在制备糖尿病肾病防治药物中的应用，其特征在于，所述LncRNA KIFAP3
‑
5:1的序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述LncRNA KIFAP3
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5:1以慢病毒作为载体。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物制成液体制剂或固体制剂。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物制成注射剂、口服液、颗粒剂、粉剂、片剂或胶囊剂。5.LncRNA KIFAP3
‑
5:1过表达慢...

【专利技术属性】
技术研发人员：印晓星，周捷玲，鲁茜，杜蕾，王蕾，何林林，
申请(专利权)人：徐州医科大学，
类型：发明
国别省市：