一种鉴定黄芪黄酮含量的CAPS标记及方法技术

本发明专利技术提供了一种鉴定黄芪黄酮含量的CAPS标记及方法，属于黄芪黄酮含量相关基因标记技术领域。本发明专利技术利用查尔酮异构酶基因中包含的一个SNP位点，该位点位于SEQ ID NO.1的466bp处，该位点为C/T的碱基突变，通过Bfal内切酶进行识别。故在查尔酮异构酶基因序列的5

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定黄芪黄酮含量的CAPS标记及方法


[0001]本专利技术涉及黄芪黄酮含量相关基因标记
，具体是涉及一种鉴定黄芪黄酮含量的CAPS标记及方法。

技术介绍

[0002]黄芪是多年生根类药用植物，黄酮属于黄芪的主要药用成分之一，临床上具有保护神经及血管内皮细胞、抗癌、抗氧化等作用。黄芪属异花授粉植物，杂交不易成功，结实率低，在选育高黄酮含量后代杂交育种中，传统的方法需要挖根进行测定以获得高含量株系，但这种方法不适合后代株系较少的黄芪材料。
[0003]酶切扩增多态性序列(CAPS)标记主要是对PCR扩增的DNA片段进行限制性酶切分析。基本原理是利用己知SNP位点的DNA序列资源设计出一对特异的PCR引物，然后利用引物扩增该SNP位点所在的DNA片段，随后用专一的限制性内切酶切割所获得扩增产物，凝胶电泳分离酶切片段，观察是否切割成功。
[0004]黄芪大部分与性状相关目的基因的主要通过基因定位获得，由于黄芪此前没有参考基因组，对于挖掘与黄酮含量相关的基因选择受到了很大的限制。酶切扩增多态性序列(CAPS)标记技术具有共显性、特异性强等特征，已被广泛应用于如小麦、玉米、水稻等作物的分子辅助育种选择，但在黄芪黄酮含量相关的种质资源筛选中未被应用。
[0005]目前有关黄芪黄酮含量的测定需要采根进行黄酮提取及测定，这对本就含量较少的资源来说是不利的，而且黄芪为多年生深根性植物，采根需要耗费大量的人力物力。

技术实现思路

[0006]本专利技术解决的技术问题是：目前有关黄芪黄酮含量的测定需要采根进行黄酮提取及测定，采根费时费力且破坏黄芪资源。
[0007]为解决上述问题，本专利技术的技术方案如下：
[0008]本专利技术提供了一种鉴定黄芪黄酮含量的CAPS标记：以查尔酮异构酶基因作为与黄酮含量相关的关键基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该CAPS标记为Bfal内切酶识别序列：C|TAG，位于所述查尔酮异构酶基因的核苷酸序列的第446位bp处。
[0009]本专利技术还提供了一种鉴定黄芪黄酮含量的方法，包括以下步骤：
[0010]S1、设计引物对
[0011]引物对包括正向引物、反向引物，正向引物的序列为如SEQ ID NO.2所示，反向引物的序列为如SEQ ID NO.3所示；
[0012]S2、DNA提取及PCR扩增；
[0013]S3、酶切识别，经过酶切识别后得到两条条带的为黄酮含量被抑制的黄芪种质资源，未被切开且只有一条条带的为黄酮含量未被抑制的黄芪种质资源。
[0014]进一步地，步骤S2为：提取黄芪种质资源DNA，并通过步骤S1提供的引物对对黄芪种质资源DNA进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳，得到黄芪种质资源DNA的查尔酮异构酶基因
扩增产物。
[0015]说明：CAPS标记为基于SNP的PCR技术与RFLP技术结合的分子标记技术，即某SNP恰好位于酶切位点上，通过对该SNP位点设计引物，经PCR扩增后获得的相应产物片段经酶切、电泳等步骤，最终通过观察不同的条带判断样本的多态性，因此，步骤S2属于CAPS标记的必要步骤之一。
[0016]进一步地，PCR扩增的体系为：50μl体系，包括：25μl FineTaqTM PCR Supermix、2μl正向引物、2μl反向引物、4μlDNA模板、17μl无菌双蒸水。
[0017]说明：CAPS标记为基于SNP的PCR技术与RFLP技术结合的分子标记技术，即某SNP恰好位于酶切位点上，通过对该SNP位点设计引物，经PCR扩增后获得的相应产物片段经酶切、电泳等步骤，最终通过观察不同的条带判断样本的多态性，因此，PCR扩增的体系属于CAPS标记的必要内容之一。
[0018]进一步地，PCR扩增的反应程序为：94℃下预变形3min；94℃下变形30sec，55℃退火30sec，72℃延伸50sec，以上过程为1个循环，进行34个循环；72℃延伸5min；得到PCR扩增产物并在4℃保存。
[0019]说明：CAPS标记为基于SNP的PCR技术与RFLP技术结合的分子标记技术，即某SNP恰好位于酶切位点上，通过对该SNP位点设计引物，经PCR扩增后获得的相应产物片段经酶切、电泳等步骤，最终通过观察不同的条带判断样本的多态性，因此，PCR扩增的反应程序属于CAPS标记的必要内容之一。
[0020]进一步地，酶切识别为：通过Bfal内切酶对上述黄芪种质资源的查尔酮异构酶基因进行酶切反应，在酶切反应结束后，得到酶切产物，再通过1％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，并在紫外灯下拍照。
[0021]说明：CAPS标记为基于SNP的PCR技术与RFLP技术结合的分子标记技术，即某SNP恰好位于酶切位点上，通过对该SNP位点设计引物，经PCR扩增后获得的相应产物片段经酶切、电泳等步骤，最终通过观察不同的条带判断样本的多态性，因此，酶切识别属于CAPS标记的必要内容之一。
[0022]更进一步地，还包括步骤S4：验证CAPS标记的准确性。
[0023]说明：通过CAPS标记准确性的验证，能够保证得到的SNP位点、设计的引物对及选取的Bfal内切酶是具有一定可靠性的。
[0024]本专利技术的有益效果是：
[0025]本专利技术提供了与黄芪黄酮含量相关的查尔酮异构酶基因CAPS标记及应用，提出了通过查尔酮异构酶基因的酶切位点C|TAG实现查尔酮异构酶基因SNP位点切割，证明了酶切查尔酮异构酶基因来评价黄芪种质资源黄酮含量的高低的准确性及可靠性，为后续黄芪黄酮含量测定提供了新的方法，避免了采根测定黄芪黄酮含量方式带来的费时费力且破坏黄芪资源的问题出现，具有省时省力、保护黄芪种质资源的优点。
附图说明
[0026]图1是实施例2一种鉴定黄芪黄酮含量的CAPS标记获取方法的流程图；
[0027]图2是实施例2中第一查尔酮异构酶基因扩增产物(2
‑
9)和第二查尔酮异构酶基因扩增产物(2
‑
7)检测结果图；
[0028]图3是实施例2中第一查尔酮异构酶基因序列(2
‑
9)和第二查尔酮异构酶基因序列(2
‑
7)的酶切检测结果图；
[0029]图4是实施例2中低黄酮含量的种质资源2
‑
10、2
‑
6、2
‑
4的基因扩增产物检测结果与酶切检测结果图；
[0030]图5是实施例5一种鉴定黄芪黄酮含量的方法流程图。
具体实施方式
[0031]为了使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术作进一步地详细描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0032]在本专利技术实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴定黄芪黄酮含量的CAPS标记，其特征在于：以查尔酮异构酶基因作为与黄酮含量相关的关键基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该CAPS标记为Bfal内切酶识别序列：C|TAG，位于所述查尔酮异构酶基因的核苷酸序列的第446位bp处。2.一种鉴定黄芪黄酮含量的方法，其特征在于，基于权利要求1所述的一种鉴定黄芪黄酮含量的CAPS标记，包括以下步骤：S1、设计引物对所述引物对包括正向引物、反向引物，正向引物的序列为如SEQ ID NO.2所示，反向引物的序列为如SEQ ID NO.3所示；S2、DNA提取及PCR扩增；S3、酶切识别，经过酶切识别后得到两条条带的为黄酮含量被抑制的黄芪种质资源，未被切开且只有一条条带的为黄酮含量未被抑制的黄芪种质资源。3.如权利要求2所述的一种鉴定黄芪黄酮含量的方法，其特征在于，所述步骤S2为：提取黄芪种质资源DNA，并通过所述步骤S1提供的引物对对黄芪种质资源DNA进行P...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁建萍，宋诗娟，王宝慧，牛景萍，
申请(专利权)人：山西农业大学，
类型：发明
国别省市：