旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在转基因植物生物反应器中的应用制造技术

本发明专利技术适用于蛋白质生物技术领域，提供了旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在转基因植物生物反应器中的应用，所述的转基因植物生物反应器中的应用是通过培育一种表达旋毛虫抗原的大豆植株来实现的。通过提供一种有效表达旋毛虫抗原的大豆植株来实现旋毛虫抗原在转基因植物生物反应器的应用，为开发安全、廉价的动物或人用蛋白提供了一种新的策略具有非常广阔的应用前景和机会。的应用前景和机会。的应用前景和机会。

【技术实现步骤摘要】
旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在转基因植物生物反应器中的应用


[0001]本专利技术属于蛋白质生物
，尤其涉及旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在转基因植物生物反应器中的应用。

技术介绍

[0002]旋毛虫引起的旋毛虫病是一种重要的人兽共患寄生虫病，其可感染150多种食肉动物和杂食动物，人主要因为生食或半生食含有旋毛虫肌幼虫的肉及肉类产品而感染。旋毛虫病不仅威胁人类公共健康，而且也给动物养殖业和食品安全带来严重的问题。此外，近些年出现了寄生虫对传统的抗蠕虫药的耐药现象，这也迫使尽快研发新的措施来控制这种传染病，开发有效的疫苗是阻止家养动物和人类感染此病的有效措施。
[0003]转基因植物生物反应器是指通过基因工程技术、利用植物细胞、组织或整株植物来生产疫苗、抗体等医用蛋白及其它生物制剂的生产体系。利用植物作为生物反应器生产医用蛋白产物、诊断试剂或功能食品在生物制药领域中受到广泛的关注，已成为当今医学和生命科学研究领域的热点。转基因植物作为生物反应器生产病原体抗原有许多优点。首先，该系统生产成本低，疫苗生产简单，易于大规模生产，便于冷藏运输。其次，植物表达系统在表达外源蛋白的折叠和组装上跟动物更为相似，从而具有与动物细胞表达产物相似的生物活性和免疫原性。第三这种蛋白加工方式仅仅是利用了土壤、空气和水，可以说是符合绿色、安全环保等特点，在社会节能减排的背景下更加具有优势。第四，植物对胃肠道的酶消化具有抗性，口服给药方法简单。因此转基因植物为开发安全、廉价的动物或人用蛋白提供了一种新的策略具有非常广阔的应用前景和机会。/>[0004]同时，现有技术中针对旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在制备转基因植物生物反应器中的相关研究尚且不足，缺少相关的研究，无法有效的实现相关的应用。

技术实现思路

[0005]本专利技术实施例的目的在于提供旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在转基因植物生物反应器中的应用，旨在解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0006]本专利技术实施例是这样实现的，旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在转基因植物生物反应器中的应用，所述的转基因植物生物反应器中的应用是通过培育一种表达旋毛虫抗原的大豆植株来实现的。
[0007]进一步的技术方案，所述的表达旋毛虫抗原的大豆植株的培育方法包括以下步骤：步骤1、目的基因的克隆：根据NCBI上旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂（Ts
‑
SPI）基因序列信息，按照植物密码子偏爱性人工合成基因，同时根据植物双元表达载体多克隆位点分子特征，分别在Ts
‑
SPI基因上游引入内切酶HidIII酶切位点，下游引入内切酶SacI酶切位点。把Ts
‑
SPI基因片段进
行HidIII和SacI酶切后连接到pTF101
‑
35s载体上，形成pTF101
‑
35s
‑ꢀ
Ts
‑
SPI，具体引物序列如下：pTF101
‑
35s Ts
‑
SPI F：GCAGA ACAGCAAGCTTATGTTATCGGTAATATTTTCTGCAG，pTF101
‑
35sTS
‑
SPI R：GATCGGGGAAATTCGAGCTCTTACCAATACGGATACAGCTGCTGA，下划线为酶切位点。
[0008]同时针对Ts
‑
SPI基因的编码区，设计PCR分子检测扩增特异性引物如下：TS
‑
SPI
‑
F:5 '
‑ꢀ
ATGTTATCGGTAATATTTTCTG
ꢀ‑
3 '；TS
‑
SPI:5 '
‑ꢀ
TTACCAATACGGATACAGCTGC
ꢀ‑
3'。
[0009]以人工合成的Ts
‑
SPI基因为模板，以pTF101
‑
35S
‑
Ts
‑
SPI F和R为引物，通过PCR扩增得到含有载体接头序列和Ts
‑
SPI基因全长PCR片段852bp，然后通过同源重组的方法克隆到pTF101
‑
35s载体中，构建好的质粒经过测序，验证正确的植物表达载体转入农杆菌EHA101中，用于下一步大豆遗传转化。
[0010]步骤2、农杆菌的转化：采用冻融法将质粒pTF101
‑
35s
‑ꢀ
TS
‑
SPI 转化至农杆菌 EHA101感受态细胞中；步骤3、农杆菌介导的大豆遗传转化：以农杆菌株EHA101为工程菌株，将pTF101
‑
35s
‑
Ts
‑
SPI通过大豆子叶节方法转入受体大豆品种Williams82中；步骤4、bar 试纸条检测：取少量嫩绿叶子(约小指甲大小)放入1.5 mL 的离心管中，加入200μL提取缓冲液，用研磨棒捣碎混匀，将试纸条按箭头方向插入混合液中，静止5min后观察结果；若试纸条出现 2 条带表明该植株是 bar阳性植株，若出现 1 条带说明是bar阴性植株，如果没有条带说明操作有误或提取缓冲液不对；步骤5、转基因植株的草丁膦抗性检测：转化载体中以草丁膦作为筛选标记，因此后代采用草丁膦涂抹叶片的方法快速检测转基因苗。具体方法为：用棉签蘸取适量草丁膦( 135 mg
·
L
‑1) 溶液， 轻柔擦拭半片叶子，并做好标记，同叶未涂抹的叶子作为对照，在正常光照情况下 3～6d 后观察叶片生长情况。
[0011]步骤6、转基因植株的PCR检测，利用Ts
‑
SPI基因引物对T0代转化植株基因组DNA进行PCR扩增检测。使用CTAB法提取转化植株及对照Willimas82的DNA，PCR扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳分离，电泳结果利用凝胶成像系统进行拍照和分析；步骤7、外源目的基因Western Blot检测：对PCR 检测呈强阳性的转基因植株，利用植物总蛋白提取试剂盒(Solarbio，BC3720)提取大豆未成熟种子中的蛋白，将变性后的蛋白样品，采用分离胶为12%、浓缩胶为5％进行SDS
‑
PAGE凝胶电泳；电泳结束后，将分离胶按照常规操作进行湿转，将蛋白转印至PVDF膜上，湿转结束后，将PVDF膜置于封闭液（5%脱脂奶粉PBST溶液）中4℃封闭过夜，之后进行一抗孵育，一抗为小鼠抗重组的Ts
‑
SPI 多抗血清，将该血清使用封闭液体1：200稀释，用稀释后的血清覆盖封闭后的PVDF膜，室温孵育1小时，之后用PBST洗涤PVDF膜3次，5min/次，继续孵育二抗，二抗为经封闭液5000倍稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG的抗体，二抗室
温箱孵育1小时，之后经PBST洗涤后，进行ECL化学发光显影，用显影仪器采集图片。
[0012]进一步的技术方案，所述步骤2的具体操作步骤为：步骤2.1、用冰本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在转基因植物生物反应器中的应用，其特征在于，所述的转基因植物生物反应器中的应用是通过培育一种表达旋毛虫抗原的大豆植株来实现的。2.根据权利要求1所述的旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在转基因植物生物反应器中的应用，其特征在于，所述的表达旋毛虫抗原的大豆植株的培育方法包括以下步骤：步骤1、目的基因的克隆：根据NCBI上旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因序列信息，登录号：XM_003379851， 按照植物密码子偏爱性人工合成基因，分别在Ts
‑
SPI基因上游引入内切酶HidIII酶切位点，下游引入内切酶SacI酶切位点；把Ts
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SPI基因片段进行HidIII和SacI酶切后连接到pTF101
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35s载体上，形成pTF101
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35s
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Ts
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SPI，具体引物序列如下：pTF101
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35s Ts
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SPI F：GCAGA ACAGC AAGCTTATGTTATCGGTAATATTTTCTGCAG，pTF101
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35sTS
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SPI R：GATCGGGGAAATTCGAGCTCTTACCAATACGGATACAGCTGCTGA，下划线为酶切位点；同时针对Ts
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SPI基因的编码区，设计PCR分子检测扩增特异性引物如下：TS
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SPI
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F:5 '
‑ꢀ
ATGTTATCGGTAATATTTTCTG
ꢀ‑
3 '；TS
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SPI:5 '
‑ꢀ
TTACCAATACGGATACAGCTGC
ꢀ‑
3'；以人工合成的Ts
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SPI基因为模板，以pTF101
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35S
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Ts
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SPI F和R为引物，通过PCR扩增得到含有载体接头序列和Ts
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SPI基因全长PCR片段852bp，然后通过同源重组的方法克隆到pTF101
‑
35s载体中，构建好的质粒经过测序，验证正确的植物表达载体转入农杆菌EHA101中，用于下一步大豆遗传转化；步骤2、农杆菌的转化：采用冻融法将质粒pTF101
‑
35s
‑ꢀ
TS
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SPI 转化至农杆菌 EHA101感受态细胞中；步骤3、农杆菌介导的大豆遗传转化：以农杆菌株EHA101为工程菌株，将pTF101
‑
35s
‑
Ts
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SPI通过大豆子叶节方法转入受体大豆品种Williams82中；步骤4、bar 试纸条检测：取嫩叶放入1.5 mL 的离心管中，加入200μL提取缓冲液，用研磨棒捣碎混匀，将试纸条按箭头方向插入混合液中，静止5min后观察结果；若试纸条出现 2 条带表明该植株是 bar阳性植株，若出现 1 条带说明是bar阴性植株，如果没有条带说明操作有误或提取缓冲液不对；步骤5、转基因植株的草丁膦抗性检测：转化载体中以草丁膦作为筛选标记，因此后代采用草丁膦涂抹叶片的方法快速检测转基因苗；步骤6、转基因植株的PCR检测，利用Ts
‑
SPI基因引物对T0代转化植株基因组DNA进行PCR扩增检测；使用CTAB法提取转化植株及对照Willimas82的DNA，PCR扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳分离，电泳结果利用凝胶成像系统进行拍照和分析；步骤7、外源目的基因Western Blot检测：对PCR 检测呈强阳性的转基因植株，提取大豆未成熟种子中的蛋白，将变性后的蛋白样品，采用分离胶为12%、浓缩胶为5％进行SDS
‑
PAGE凝胶电泳；电泳结束后，将分离胶按照
常规操作进行湿转，将蛋白转印至PVDF膜上，湿转结束后，将PVDF膜置于封闭液中4℃封闭过夜，之后进行一抗孵育，一抗为小鼠抗重组的Ts
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SPI 多抗血清，将该血清使用封闭液体1：200稀释，用稀释后的血清覆盖封闭后的PVDF膜，室温孵育1小时，之后用PBST洗涤PVDF膜3次，5min/次，继续孵育二抗，二抗为经封闭液5000倍稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG的抗体，二抗室温箱孵育1小时，之后经PBST洗涤后，进行ECL化学发光显影，用显影仪器采集图片。3.根据权利要求2所述的旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在转基因植物生物反应器中的应用，其特征在于，所述步骤2的具体操作步骤为：步骤2.1、用冰盒取
‑
80℃冰箱冻存的pTF101
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35s感受态细胞，冰浴 10min；步骤2.2、将1
µ
g提取的纯化质粒pTF101
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35s
‑ꢀ
Ts
‑
SPI 加入 200
µ
l 农杆菌感受细胞中，混匀；步骤2.3、冰浴5
‑
10min，转入液氮冷冻3
‑
5min，迅速置于37℃水浴中热激5min； 步骤2.4、加入500
µ
l 28℃预热的 YEP 液体培养基，28℃，200rpm 震荡培养3
‑
4h；步骤2.5、取 200
µ
l 菌液涂布于 YEP 固体选择...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨勇，张玲，李承瑶，刘红丽，王海龙，
申请(专利权)人：山西医科大学，
类型：发明
国别省市：