一种可同时检测三种食源性致病菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种可同时检测三种食源性致病菌的方法，属于食源性致病菌检测领域，该方法为：步骤一、生物传感器芯片表面修饰；步骤二、传感器活化；步骤三、抗体固定化；步骤四、一次封闭；步骤五、二次封闭；步骤六、样品检测及结果分析。本发明专利技术的有益效果：同时检测三种食源性病原体，即大肠杆菌O157:H7、肠炎沙门氏菌和单增李斯特菌，节省检测时间，提高检测效率；灵敏度高；无需任何标记；传感器可再生，再生后的传感器可用于其他组样品的检测，降低检测成本；传感器经过两次封闭，抑制非特异性信号的产生，具有较好的特异性。具有较好的特异性。具有较好的特异性。

【技术实现步骤摘要】
一种可同时检测三种食源性致病菌的方法


[0001]本专利技术涉及食源性致病菌的快速检测方法。

技术介绍

[0002]食源性致病菌是以食物为主要载体的致病性细菌。这些致病菌可以在食物中生存，致病菌污染的食物被人食用后可能引起食物中毒和一系列疾病。食源性致病菌的检测是预防与控制食物中毒及相关疾病的关键。一直被认为是“黄金标准”的传统检测方法操作繁琐，耗时长、时效性差。已开发出的有代表性的食源性致病菌快速检测方法有酶联免疫吸附(ELISA)、聚合酶链式反应(PCR)等，这些方法较传统的致病菌检测方法有所改进，但仍有许多不足之处，如容易受到污染导致假阳性结果出现(PCR)，灵敏度不高、对试剂的选择性高(ELISA)。而多种食源性致病菌的同时快速特异性检出仍然是一个技术难题。因此，开发快速、灵敏、可靠的食源性致病菌检测方法仍是当务之急。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于，解决传统检测食源性病原体方法中单目标菌检测、灵敏度低等问题而提供的一种可同时检测三种食源性致病菌的方法。
[0004]本专利技术提出了一种可同时检测三种食源性致病菌的方法。该方法包括生物传感器芯片表面修饰、传感器活化、抗体固定化、一次封闭、二次封闭、样品检测及结果分析，其具体步骤如下：
[0005]步骤一、生物传感器芯片表面修饰：将清洗干净的传感器芯片浸泡在0.1mM羧基
‑
EG6‑
十六烷基硫醇(PEG6)和0.9mM羟基
‑
EG3‑
十六烷基硫醇(PEG3)的混合液中25℃避光保存24h，使得在传感器芯片的Au膜表面形成自组装单分子膜(SAM)；
[0006]步骤二、传感器活化：将生物传感器芯片加盖有独立流路的硅胶盖板后组装到SPR仪器中，加入0.1M N
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羟基琥珀酰亚胺(NHS)和0.4M 1
‑
乙基
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)的混合液，以中等流速(约30μL/min)运行10min，活化SAM上的羧基基团；
[0007]步骤三、抗体固定化：通过共价结合的方式将浓度为100μg/mL的大肠杆菌O157:H7抗体、沙门氏菌抗体、李斯特菌抗体分别固定在多通道SPR传感器的相应检测通道上；
[0008]步骤四、乙醇胺盐酸盐溶液一次封闭：加入1M乙醇胺盐酸盐溶液(pH 8.5)运行10min，封闭SAM上未与抗体结合的羧基基团；
[0009]步骤五、牛血清白蛋白溶液二次封闭：加入1％牛血清白蛋白溶液运行6min，封闭传感器芯片表面上未形成SAM的部位；
[0010]步骤六、样品检测及结果分析：将有独立流路的硅胶盖板拆除，在生物传感器芯片上加盖有横穿流路的硅胶盖板后将其组装到SPR仪器中。加入HBS
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EP缓冲液运行5min以建立基线，然后加入样品进行大肠杆菌O157:H7、肠炎沙门氏菌和单增李斯特菌的同时检测，记录样品运行结束后60秒的结合信号与样品运行开始前30秒的结合信号的差值，根据结合信号分析检测结果。
[0011]本专利技术的有益效果：
[0012]本专利技术提供的一种可同时检测三种食源性致病菌的方法灵敏度高、无需任何标记；可以同时检测三种食源性病原体，即大肠杆菌O157:H7、肠炎沙门氏菌和单增李斯特菌，节省检测时间，提高检测效率；传感器可再生后用于其他组样品的检测，降低检测成本；传感器经过两次封闭，抑制非特异性信号的产生，具有较好的特异性。
附图说明
[0013]图1是本专利技术所述检测方法特异性检测结果图。
[0014]图2是本专利技术所述检测方法中纯水中大肠杆菌O157:H7、肠炎沙门氏菌和单增李斯特菌的同时检测结果图。
[0015]图3是本专利技术所述检测方法中鸡肉中大肠杆菌O157:H7、肠炎沙门氏菌和单增李斯特菌的同时检测结果图。
具体实施方式
[0016]以下对本专利技术及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，实际的实施方式并不局限于此。
[0017]实施例中用到的主要材料与试剂见表1，主要仪器设备见表2。
[0018]表1主要材料与试剂信息表
[0019][0020]表2主要仪器设备信息表
[0021][0022]实施例1：本技术方案的特异性考察
[0023]以只含2种非目标菌的检测样品即只含沙门氏菌和单增李斯特菌的样品、只含大肠杆菌O157:H7和单增李斯特菌的样品、只含大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌的样品为对照样品进行特异性检测分析，具体步骤如下：
[0024](1)用接种环将大肠杆菌O157:H7、肠炎沙门氏菌和单增李斯特菌单独接种于5ml已灭菌的胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)中，37℃振荡过夜培养。培养液用PBS缓冲液系列梯度稀释，取2种非目标菌的107倍稀释液各400μl分别接种到25ml纯水中，加入225ml共增菌肉汤，用拍击式均质器均质30s后置于37℃恒温培养24小时，得到三类两种菌的共增菌培养液。
[0025](2)共增菌培养液4℃、9100
×
g离心5min收集菌体，菌体沉淀用HBS
‑
EP缓冲液洗涤2次后重悬于HBS
‑
EP缓冲液中。菌悬液经超声波细胞破碎仪破碎，超声功率为50W，超声时间为3min(工作时间30s，停顿时间30s为一个超声周期)。超声处理后的菌悬液4℃、15000
×
g离心10min，弃去上清液，沉淀用HBS
‑
EP缓冲液重悬。悬液即为检测样品，置于冰箱冷冻保存待检。
[0026](3)将清洗干净的传感器芯片浸泡在0.1mM羧基
‑
EG6‑
十六烷基硫醇(PEG6)和0.9mM羟基
‑
EG3‑
十六烷基硫醇(PEG3)的混合液中25℃避光保存24h，使得在传感器芯片的Au膜表面形成自组装单分子膜(SAM)。
[0027](4)将生物传感器芯片加盖有独立流路的硅胶盖板后组装到SPR仪器中依次加入0.1M N
‑
羟基琥珀酰亚胺(NHS)和0.4M 1
‑
乙基
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)的混合液、抗体溶液、乙醇胺盐酸盐溶液、牛血清白蛋白溶液。
[0028](5)将有独立流路的硅胶盖板拆除，在生物传感器芯片加盖有横穿流路的硅胶盖板后将其组装到SPR仪器中依次加入HBS
‑
EP缓冲液、待测样品。
[0029](6)仪器运行时可实时观察结合信号值，读取样品运行结束后60秒的结合信号与样品运行开始前30秒的结合信号的差值，如图1所示，当只含有2种非目标菌的检测样品加入到多通道SPR生体分子相互作用仪后，固定了李斯特菌抗体的通道5、固定了沙门氏菌抗体的通道3以及固定了大肠杆菌O157:H7抗体的通道1所产生的信号值均为负值本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可同时检测三种食源性致病菌的方法，其特征在于：包括生物传感器芯片表面修饰、传感器活化、抗体固定化、一次封闭、二次封闭、样品检测及结果分析，其具体步骤如下：步骤一、生物传感器芯片表面修饰：将清洗干净的传感器芯片浸泡在0.1mM羧基
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EG6‑
十六烷基硫醇和0.9mM羟基
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EG3‑
十六烷基硫醇的混合液中25℃避光保存24h，使得在传感器芯片的Au膜表面形成自组装单分子膜；步骤二、传感器活化：将生物传感器芯片加盖有独立流路的硅胶盖板后组装到SPR仪器中，加入0.1M N
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羟基琥珀酰亚胺和0.4M 1
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乙基
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二甲基氨基丙基碳二亚胺盐酸盐的混合液，以30μL/min的流速运行10min，活化自组装单分子膜上的羧基基团；步骤三...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓光，邓龙雪，尚益帆，褚泽敬，冷雨薇，刘雨成，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：