一种快速高通量检测赤芝原生质体细胞壁再生的方法及其应用技术

本发明专利技术属于食用菌育种技术领域，具体涉及一种利用流式细胞术测定赤芝原生质体细胞壁再生的方法及其应用；将TPFN荧光探针用于赤芝原生质体的流式荧光标记，从而区分原生质体与细胞壁再生的原生质体，并可通过流式数据处理实现对原生质体细胞壁再生过程的量化监测。将待测原生质体与探针孵育10分钟，再通过流式细胞仪的BluFL2通道采集数据，与对照样品的荧光强度直方图相比较，则可判断细胞壁再生程度。与传统的电镜成像方法相比，本发明专利技术能够在15分钟内实现细胞数大于5000个的原生质体样品分析，可发展为快速判断原生质体活性的方法以及细胞壁再生监测的手段，为灵芝育种以及灵芝细胞壁相关的生理代谢研究提供重要工具。胞壁相关的生理代谢研究提供重要工具。胞壁相关的生理代谢研究提供重要工具。

【技术实现步骤摘要】
一种快速高通量检测赤芝原生质体细胞壁再生的方法及其应用


[0001]本专利技术属于食用菌育种
，具体涉及一种利用流式细胞术测定赤芝原生质体细胞壁再生的方法及其应用。

技术介绍

[0002]赤芝(Ganoderma lingzhi)是灵芝的一种，作为药物已正式被国家药典收载，可以抗肿瘤、保肝解毒、抗衰老、抗神经衰弱等等，同时它又是国家批准的新资源食品，无毒副作用。近年来，我国灵芝产量逐年增加，人工栽培规模不断过大，但仍无法满足人们对灵芝子实体的实际需求量。研究灵芝原生质体的制备以及细胞壁的再生过程对灵芝的遗传育种具有重要的参考价值。
[0003]赤芝为担子菌类多孔菌科灵芝属，属于大型真菌，外层有细胞壁，在维持细胞固有形态及完整上扮演重要角色，此外，还可维持细胞正常代谢、离子交换和渗透压。通过机械或酶解的方法处理细胞壁后可以得到原生质体，原生质体是指在人为条件下，去除原有细胞壁或抑制新生细胞壁后所得到的仅有一层细胞膜包裹着的圆球状对渗透敏感的菌体，在合适的培养条件下可以再生细胞壁。
[0004]真菌细胞壁作为细胞的外层结构，是一个由多糖和蛋白质组成的复杂矩阵。它不仅对保持细胞的完整性和形状至关重要，而且对整个细胞周期的进展也很重要。真菌细胞壁的结构和组成在应对环境条件和强加的压力时受到高度调节。因此，分析细胞壁的动态变化将是澄清细胞壁在细胞生长、发育、形态发生和压力条件中的作用的一个基本方法。原生质体再生通常被用来探索细胞壁的合成及其在各种条件下的改变。值得注意的是，原生质体的细胞壁再生使研究者能够以可控的方式从细胞壁生长的最初步骤开始研究真菌的形态发生，这对阐明细胞壁成分的功能很有帮助。细胞壁再生过程中的形态学评估主要依靠基于电子显微镜的图像分析，如扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)，它们可以实现精确的可视化和丰富的细节。然而，电子显微镜方法不适合动态监测体内原生质体的再生过程，因为其样品必须经过固定和脱水过程。同时，由于单一的显微镜图像所提供的信息是零散的、不连续的，因此也很难对特定样品中的形态特征参数进行量化。通常情况下，电子显微镜的综合研究需要对每个视图逐一进行单独的分析，这需要大量的工作。因此，细胞壁再生的特征需要开发一种集体的、快速的、非破坏性的方法
[0005]目前我国利用显微镜观测细胞壁再生过程的方法具有耗时、成本高和过程繁琐的缺陷，因此需要一种快速量化的方法，本专利技术提出了利用流式细胞仪观测细胞壁再生过程的方法。现在流式细胞仪可检测更多的荧光参数，利用不同颜色的荧光染料可同时检测同一个细胞上的所有这些参数。流式细胞仪运行速度快且具有单细胞水平检测能力，能够快速分析和鉴定数百万个细胞，可以降低实验成本，减少实验准备时间，具有超高性价比。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供了一种快速高通量检测赤芝原生质体细胞壁再生的方法，该方法操作简单、效率高、检测准确，所使用TPFN探针不影响真菌原生质体细胞的活力和再生率。
[0007]为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：
[0008]一种快速高通量检测赤芝原生质体细胞壁再生的方法，包括如下步骤：
[0009](1)TPFN核酸探针的合成
[0010]将两种全氟碳化合物进行反应合成形成化合物B作为疏水锚定单元，以具有15个碱基的核酸序列作为亲水单元，再与红色荧光发射的TAMRA分子通过固相合成形成TPFN探针，如下式所示，并对产物进行表征；
[0011][0012](2)对细胞壁重生与否的区分
[0013]选取原生质体及细胞壁再生原生质体，清洗后均加入所述TPFN探针孵育，通过流式细胞仪区分原生质体与细胞壁再生原生质体；
[0014](3)细胞壁重生的监测
[0015]分别将清洗后加入TPFN探针孵育的原生质体培养不同时间，利用流式细胞仪验证TPFN探针监测原生质体生长细胞壁的过程。
[0016]进一步的，步骤(1)中，所述两种全氟碳化合物为3
‑
(全氟辛基)丙基碘化物和4
‑
氨基苯酚，通过亲核反应合成化合物B；将化合物B与核酸序列3
’
端偶联，再将核酸链5
’
与四甲基罗丹明(TAMRA)荧光分子反应合成带有荧光标记的TPFN探针。
[0017]进一步的，步骤(1)中，对产物进行表征是指对合成反应的中间产物化合物A和化合物B进行核磁共振鉴定；用质谱鉴定TPFN探针的合成，TPFN的理论分子量为6215.9g/mol，观察到实际的质量峰为6214.7g/mol。
[0018]进一步的，步骤(2)中，区分原生质体与细胞壁再生原生质体，是将原代原生质体和细胞壁再生原生质体分别用TPFN孵育，通过比较流式细胞术荧光强度不同来实现的。
[0019]进一步的，步骤(3)中，所述分别将清洗后加入TPFN探针孵育的原生质体培养不同时间是指分别培养0、12、24、36、48、60h，将在SDB培养基中培养60h使细胞壁完全生长的原生质体作为阴性样品，然后用TPFN孵育；在用流式细胞术分析时，在左侧范围样本全是阴性样本时设置直方图的范围下限；阳性样本定义为新鲜制备的原生质体，然后在相同条件下用TPFN孵育；上限设置为左侧范围包含70％的阳性样本；在范围内的样本被计算为染色细胞的比例，从而对原生质体再生进行集体量化。
[0020]进一步的，TPFN核酸探针的合成过程包括如下步骤：
[0021]一、在氮气保护下，将3
‑
(全氟辛基)碘化丙基、4
‑
氨基苯酚和N,N
‑
二异丙基乙胺(DIPEA)溶于无水二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，在120℃油浴中搅拌过夜；冷却至室温后，在
反应混合物中加入饱和NaHCO3水溶液，再少量多次加入乙酸乙酯萃取3次；收集有机化合物，用无水Na2SO4干燥，硅胶色谱层析柱对所得有机化合物进行分离提纯，得到化合物A；
[0022]二、将化合物A溶解在盛有20ml无水二氯甲烷的圆底烧瓶中，圆底烧瓶置于冰上，在氮气保护下加入N,N
‑
二异丙基乙胺。冷却后加入2
‑
氰基乙基N,N
‑
二异丙基氯磷酰胺,室温下搅拌反应3h；用饱和NaHCO3水溶液洗涤反应混合物2
‑
3次并收集；收集的有机化合物用无水Na2SO4干燥；硅胶色谱层析柱对所得有机化合物进行分离提纯，并通过旋转蒸发仪浓缩干燥，得到化合物B；
[0023]二、化合物B合成后，通过核酸固相合成将磷酰亚胺和所需的核酸随机序列NNNNNNNNNNNNNNN合成，并标记TAMRA分子。
[0024]进一步的，步骤(2)具体如下：
[0025]选取原生质体及细胞壁再生原生质体，血球计数板计数确定浓度，稀释到10000个/mL，4000g离心10min后PBS清洗2
‑
3次，分别重悬于400μL PBS溶液，取200μL加入5μL本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速高通量检测赤芝原生质体细胞壁再生的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)TPFN核酸探针的合成将两种全氟碳化合物进行反应合成形成化合物B作为疏水锚定单元，以具有15个碱基的核酸序列作为亲水单元，再与红色荧光发射的TAMRA分子通过固相合成形成TPFN探针，如下式所示，并对产物进行表征；(2)对细胞壁重生与否的区分选取原生质体及细胞壁再生原生质体，清洗后均加入所述TPFN探针孵育，通过流式细胞仪区分原生质体与细胞壁再生原生质体；(3)细胞壁重生的监测分别将清洗后加入TPFN探针孵育的原生质体培养不同时间，利用流式细胞仪验证TPFN探针监测原生质体生长细胞壁的过程。2.根据权利要求1所述的一种快速高通量检测赤芝原生质体细胞壁再生的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述两种全氟碳化合物为3
‑
(全氟辛基)丙基碘化物和4
‑
氨基苯酚，通过亲核反应合成化合物B；将化合物B与核酸序列3
’
端偶联，再将核酸链5
’
与四甲基罗丹明(TAMRA)荧光分子反应合成带有荧光标记的TPFN探针。3.根据权利要求1所述的一种快速高通量检测赤芝原生质体细胞壁再生的方法，其特征在于，步骤(1)中，对产物进行表征是指对合成反应的中间产物化合物A和化合物B进行核磁共振鉴定；用质谱鉴定TPFN探针的合成，TPFN的理论分子量为6215.9g/mol，观察到实际的质量峰为6214.7g/mol。4.根据权利要求1所述的一种快速高通量检测赤芝原生质体细胞壁再生的方法，其特征在于，步骤(2)中，区分原生质体与细胞壁再生原生质体，是将原代原生质体和细胞壁再生原生质体分别用TPFN孵育，通过比较流式细胞术荧光强度不同来实现的。5.根据权利要求1所述的一种快速高通量检测赤芝原生质体细胞壁再生的方法，其特征在于，步骤(3)中，以在SDB培养基中培养60h使细胞壁完全生长的原生质体作为阴性样品，然后用TPFN孵育并用流式细胞仪采集BluFL2通道下数据；在用流式细胞术分析时，以荧光强度为横坐标，数量为纵坐标，以直方图左侧包含100％的事件对应的荧光强度值为量化统计设门下限；阳性样本定义为新鲜制备的原生质体，然后在相同条件下用TPFN孵育并采集数据；以相同方法进行分析，以直方图左侧包含70％的事件对应的荧光强度值为量化统计设门上限：根据上限与下限得到量化统计门。将原生质体细胞壁再生不同时间后用PBS清洗，再加入TPFN探针孵育并采集流式数据，在量化统计门内统计TPFN染色细胞的比例，从而对原生质体再生进行量化。6.根据权利要求1所述的一种快速高通量检测赤芝原生质体细胞壁再生的方法，其特
征在于，TPFN核酸探针的合成过程包括如下步骤：一、在氮气保护下，将3
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(全氟辛基)碘化丙基、4
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氨基苯酚和N,N
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【专利技术属性】
技术研发人员：邓意达，石沐玲，洪超，黄露，米旭君，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：