一种用于预测儿童肝脏移植术后免疫耐受的试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种用于预测儿童肝脏移植术后免疫耐受的试剂盒，含有检测外周血CD45RA+CCR7

【技术实现步骤摘要】
一种用于预测儿童肝脏移植术后免疫耐受的试剂盒


[0001]本专利技术属于生物医学领域，涉及一种检测试剂盒，具体来说是一种用于预测儿童肝脏移植术后免疫耐受的试剂盒。

技术介绍

[0002]肝脏移植是目前治疗儿童终末期肝病的唯一有效手段，然而异体移植物在受体中面临免疫排斥风险，因此需终生服用免疫抑制剂。免疫抑制剂长期使用存在诸多副作用。因此，如何实现肝移植术后免疫抑制剂的个体化用药，降低或停止肝移植受体免疫抑制剂暴露，已成为提高移植术后长期生存率的关键。
[0003]我们在儿童肝移植受体长期随访中发现，部分受体(1.1％)可停用免疫抑制剂达到免疫耐受状态，这提示服用常规剂量免疫抑制剂的儿童肝移植受体中存在可以免疫耐受的受体。
[0004]然而，目前尚缺乏高效的预测免疫耐受的临床指标和诊断方法。以往研究因样本规模较小以及相关技术限制，免疫耐受临床预测指标的可重复性和准确性均不理想。
[0005]CD8+T细胞作为人体免疫系统组成的重要部分，其在肝移植免疫耐受中发挥的作用还有待深入研究。目前有报道可以根据CD45RA和CCR7的表达情况将CD8+T细胞分为具有不同功能的亚群。我们发现CD45RA+CCR7
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(简称为CD45RA+CCR7
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CD8+T细胞)是与肝移植后免疫耐受高度相关的CD8+T细胞亚群。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种用于预测儿童肝脏移植术后免疫耐受的试剂盒，所述的这种用于预测儿童肝脏移植术后免疫耐受的试剂盒要解决现有技术中缺乏高效的预测免疫耐受的临床指标的技术问题。
[0007]本专利技术提供了一种用于预测儿童肝脏移植术后免疫耐受的试剂盒，含有检测外周血CD45RA+CCR7
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CD8+T细胞和总CD8+T细胞数的试剂，如果外周血CD45RA+CCR7
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CD8+T细胞数占总CD8+T细胞数的比例高于30％，说明儿童肝移植受体只需要服用低剂量甚至停用免疫抑制剂即可维持稳定的肝功能。
[0008]进一步的，含有如下的试剂：乙二胺四乙酸(EDTA)、磷酸盐缓冲液、水溶性聚蔗糖(Ficoll)、抗人CD3流式抗体(Brilliant Violet 510
TM
anti
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human CD3)、抗人CD8a流式抗体(APC/Cyanine7 anti
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human CD8a)、抗人CD45RA流式抗体(FITC anti
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human CD45RA)、抗人CCR7流式抗体(BB700 anti
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Human CCR7)。
[0009]进一步的，采用流式细胞仪检测肝移植儿童受者外周血CD45RA+CCR7
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CD8+T细胞占总CD8+T细胞的比例。
[0010]本专利技术建立了一套完整成熟的分析和分离人体外周血CD45RA+CCR7
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CD8+T细胞方法，先用Ficoll分离外周血单个核细胞，然后通过流式抗体染色进行分析和分选。该方法的建立极大提升儿童肝移植术后免疫耐受状态的临床预测和诊断，从而指导儿童肝移植受者
术后的免疫抑制剂使用。
[0011]本专利技术和已有技术相比，其技术效果是积极和明显的。本专利技术利用流式细胞仪分析少量外周血样本中CD45RA+CCR7
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CD8+T细胞比例即可达到精确预测目标。采用专利技术的方法，样本使用量少，样本获取创伤性小，检测技术成熟，检测结果准确。
附图说明
[0012]图1显示了儿童肝移植受者外周血CD45RA+CCR7
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CD8+T细胞比例分析。其中，A.流式细胞术分析儿童肝移植受者外周血CD45RA+CCR7
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CD8+T细胞比例策略。B.肝移植术后不同免疫状态儿童受者外周血CD45RA+CCR7
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CD8+T细胞比例比较(High:使用高剂量免疫抑制剂受者
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免疫不耐受，Low:使用低剂量免疫抑制剂受者
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免疫耐受，Stop:停用免疫抑制剂受者
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免疫耐受)。C.受试者工作特征曲线(ROC曲线)显示CD45RA+CCR7
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CD8+T细胞比例预测儿童肝移植术后免疫耐受的敏感性和特异性。
[0013]图2显示了儿童肝移植受者外周血CD45RA+CCR7
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CD8+T细胞分析流程。
具体实施方式
[0014]实施例1
[0015]本专利技术提供一种用于预测儿童肝脏移植术后免疫耐受的试剂盒，采用上述的试剂盒检测和外周血流式细胞分析预测儿童肝移植免疫耐受的过程如下：
[0016]按照血液标本获得，流式细胞染色，样本数据采集的方式实施(图2)。具体如下：1.血液标本的获取与运输
[0017]1.1使用含有EDTA的抗凝静脉采血管采集2毫升儿童肝移植受者外周静脉血样本。
[0018]1.2血液样本应将储存在0
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4℃的低温环境中,并在24h内运至实验室进行相关操作。
[0019]2.提取外周血单个核淋巴细胞(PBMC)
[0020]2.1将静脉采血管20℃400g离心10min,弃上清，取1毫升磷酸盐缓冲液(PBS)加入剩余血液中并重悬细胞获得悬液。
[0021]2.2取15ml离心管加入1毫升Ficoll，随后将血液细胞悬液缓慢加入Ficoll上层，20℃400g升速为3，降速为0，离心20min。
[0022]2.3将离心后位于液体中间的白色单个核细胞层吸出转入新的离心管，加入5倍体积的PBS，4℃400g离心5min；去上清，用100uL PBS重悬获得PBMC悬液。
[0023]3.流式细胞分析
[0024]3.1表面抗原染色：
[0025]100uL的PBMC悬液中加入如下流式细胞分析抗体各0.4uL，0
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4℃的低温环境中避光孵育30分钟。
[0026]Brilliant Violet 510
TM
anti
‑
mouse CD3(Biolegend，100234)；
[0027]APC/Cyanine7 anti
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human CD8a(Biolegend，300926)；
[0028]FITC anti
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human CD45RA(Biolegend，304106)；
[0029]BB700 anti
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Human CCR7(Biolegend，566438)。
[0030]3.2清洗未结合抗体
[0031]PBMC悬液中加入1mL PBS后4℃400g离心5min；去上清，用300uLPBS重悬，得到最终样本。
[0032]3.3数据采集
[0033本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于预测儿童肝脏移植术后免疫耐受的试剂盒，其特征在于，含有检测外周血CD45RA+CCR7
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CD8+T细胞和总CD8+T细胞的试剂，如果外周血CD45RA+CCR7
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CD8+T细胞数占总CD8+T细胞数的比例高于30％，说明儿童肝脏移植受者只需要服用低剂量甚至停用免疫抑制剂即可维持稳定的肝功能。2.根据权利要求1所述的一种用于预测儿童肝脏移植...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏强，刘永波，刘源，占贞贞，周艾炜，潘齐，王炳然，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属仁济医院，
类型：发明
国别省市：