基于时珍法的中药鉴定方法及应用技术

本申请公开了基于时珍法的中药鉴定方法及应用，其中，利用中药基原物种的核、叶绿体和线粒体基因组得到标准特异性靶标序列，从而能够基于所述标准特异性靶标序列实现对待检测样品的物种鉴定。时珍法可筛选获得判定任意待检测中药样品与指定中药基原物种同一性的标准特异性靶标序列，消除了脱靶等失误风险，由此，时珍法可准确判定任意待检测中药样品与指定中药基原物种的同一性。定中药基原物种的同一性。定中药基原物种的同一性。

【技术实现步骤摘要】
基于时珍法的中药鉴定方法及应用


[0001]本申请涉及中药鉴定
，具体涉及一种基于时珍法(Analysis of whole
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GEnome，AGE，又称全基因组分析法或阿哥法)的中药鉴定方法及应用。

技术介绍

[0002]中医药是一个传承千年的伟大宝库，蕴含着无数先贤与疾病作斗争积累下来的宝贵经验与智慧。中药的传统鉴定方法(如眼观、手摸、口尝)现已无法满足高时效性发展的中药鉴定需求，而基于指标性成分检测的理化鉴定方法往往无法解决人为掺假等鉴定难题。DNA分子鉴定方法通过识别物种固有的特异性DNA序列进行鉴定，具有客观、灵敏、专属性强、简便易行、易于标准化等优点，正在中药鉴定领域发挥着越来越重要的作用。
[0003]核、叶绿体和线粒体基因组作为物种全部遗传信息的载体，能够提供大量的物种特异性DNA序列，是中药鉴定的理想数据库，但由于技术方面的限制，目前尚无基于核、叶绿体和线粒体基因组的中药分子鉴定方法。
[0004]此前已有多种物种特异性DNA序列的识别方法，包括CRISPR/Cas系统、TaqMan probe
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based real
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time PCR系统、PCR系统和Sanger测序系统等。CRISPR/Cas系统是依赖Cas蛋白(如Cas12a和Cas13a)的反式切割活性：crRNA特异性识别靶标序列后Cas蛋白反式切割活性被激活，可非特异性切割单链DNA荧光信号分子，产生可检测的荧光。该反应在37℃下进行，操作简单，仅需要恒温与荧光检测仪器。TaqMan probe
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based real
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time PCR系统通过在PCR反应过程中添加特异性识别靶标序列的荧光探针，可通过检测荧光信号鉴定物种。该方法需要实时荧光定量PCR仪，结果较为准确。PCR系统通过设计特异性识别靶标序列的引物，PCR后通过电泳进行物种鉴别，最为简便，但特异性较弱。Sanger测序系统的检测结果最为准确，但需要测序仪器，检测相对繁琐，时间较长。除了上述特异性DNA序列检测方法，其他序列检测方法同样可用，适用于不同应用场景。但是目前已经筛选得到的物种特异性靶标序列往往具有特异性较低、脱靶风险高等缺点，如何构建得到适宜的物种特异性靶标序列的文库成为制约已有的DNA序列识别方法在中药分子鉴定方面的广泛应用的关键因素。

技术实现思路

[0005]本专利技术的物种鉴定方法(以下称为时珍法)将核、叶绿体和线粒体基因组分析与不同的靶标序列检测方法相结合，实现了从核、叶绿体和线粒体基因组层面进行中药鉴定。与现有技术相比，时珍法通过从核、叶绿体和线粒体基因组中筛选用于鉴定的候选靶标序列，根据应用场景选择不同检测方法并筛选相应的物种标准特异性靶标序列，充分挖掘了核、叶绿体和线粒体基因组应用于物种鉴定的潜力。考虑到核、叶绿体和线粒体基因组蕴含的巨大信息以及不同的靶标序列检测方法提供的靶标序列选择多样性，理论上时珍法可通过多种相对简单且成本更低的方法确定待检测样品基因组是否存在特异性靶标序列，不需要对样品的全基因组进行测序即可判定任意待检测中药样品与指定中药基原物种的同一性，
消除了脱靶等失误风险，由此，时珍法可准确判定任意待检测中药样品与指定中药基原物种的同一性。
[0006]在一个方面，本专利技术提出了一种基于时珍法的中药鉴定方法，包括：
[0007](1)获得中药基原物种的核、叶绿体和线粒体基因组序列，构建小片段基因组文库；
[0008](2)从所述小片段基因组文库中提取候选靶标序列并进行分析，从所述候选靶标序列中筛选符合选自筛选条件(a)至(d)中的至少一种的候选序列作为标准特异性靶标序列，所述筛选条件包括：
[0009](a)候选序列GC含量为40％
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60％；
[0010]候选序列不能含有四核苷酸及以上重复序列、连续的三核苷酸重复序列、不连续的3个及以上的三核苷酸重复序列；
[0011]候选序列不能与crRNA重复序列互补；
[0012]候选序列5'端6个核苷酸中G+C含量为30％
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80％；
[0013]候选序列与混伪品及近缘物种的核、叶绿体和线粒体基因组序列进行比对至少含有3个差异核苷酸；和/或
[0014]候选序列所在区域
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50bp到+300bp或
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300bp到+50bp内不存在连续4个以上A或GT重复；
[0015](b)候选序列及扩增候选序列所在区域的引物中的G+C含量为30％
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80％；
[0016]根据候选序列设计的荧光探针与上下游扩增候选序列所在区域的引物退火温度分别为55℃
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60℃以及68℃
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70℃，且引物对间退火温度相差不超过2℃；
[0017]候选序列及扩增候选序列所在区域的引物长度为15
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30bp；
[0018]上下游扩增候选序列所在区域的引物间隔50
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150bp且正向引物靠近根据候选序列设计的荧光探针；
[0019]根据候选序列设计的荧光探针与上下游扩增候选序列所在区域的引物不含发卡结构且引物对不能形成二聚体；
[0020]上下游扩增候选序列所在区域的引物3'端5bp内G/C碱基不超过两个；
[0021]根据候选序列设计的荧光探针中的C碱基多于G碱基；和/或
[0022]候选序列与混伪品及近缘物种的核、叶绿体和线粒体基因组进行比对
[0023]至少含有2个差异核苷酸；
[0024](c)根据候选序列设计的扩增引物GC含量为40％
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60％，且四种核苷酸均匀分布，不存在聚嘌呤及聚嘧啶，不含GC富含区；
[0025]根据候选序列设计的扩增引物长度为18
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30bp，引物对间相差不超过3个碱基；
[0026]根据候选序列设计的扩增引物不含反向重复序列以及大于3bp的自互补序列，引物间不能形成二聚体；
[0027]根据候选序列设计的扩增引物退火温度为55
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60℃，引物对之间的退火温度相差不超过2℃；
[0028]根据候选序列设计的扩增引物3'端5个碱基中的G/C碱基多于一个但不超过三个；和/或
[0029]候选序列与混伪品及近缘物种的核、叶绿体和线粒体基因组进行比对至少含有2
个差异核苷酸；
[0030]或者，(d)候选序列所在区域为纯合的；
[0031]候选序列所在区域的GC含量在30％
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80％；
[0032]候选序列所在区域不能含有四个以上连续的重复核苷酸；
[0033]候选序列所在区域不能含有甲基化序列；
[0034]候选序列所在区域不能存在发卡结构；和/或
[0035]候选序列与混伪品及近缘物种的核、叶绿体和线粒体基因组进行比对至少含有2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于时珍法的中药鉴定方法，包括：(1)获得中药基原物种的核、叶绿体和线粒体基因组序列，构建小片段基因组文库；(2)从所述小片段基因组文库中提取候选靶标序列并进行分析，从所述候选靶标序列中筛选符合选自筛选条件(a)至(d)中的至少一种的候选序列作为标准特异性靶标序列，所述筛选条件包括：(a)候选序列GC含量为40％
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60％；候选序列不能含有四核苷酸及以上重复序列、连续的三核苷酸重复序列、不连续的3个及以上的三核苷酸重复序列；候选序列不能与crRNA重复序列互补；候选序列5'端6个核苷酸中G+C含量为30％
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80％；候选序列与混伪品及近缘物种的核、叶绿体和线粒体基因组序列进行比对至少含有3个差异核苷酸；和/或候选序列所在区域
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50bp到+300bp或
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300bp到+50bp内不存在连续4个以上A或GT重复；(b)候选序列及扩增候选序列所在区域的引物中的G+C含量为30％
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80％；根据候选序列设计的荧光探针与上下游扩增候选序列所在区域的引物退火温度分别为55℃
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60℃以及68℃
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70℃，且引物对间退火温度相差不超过2℃；候选序列及扩增候选序列所在区域的引物长度为15
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30bp；上下游扩增候选序列所在区域的引物间隔50
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150bp且正向引物靠近根据候选序列设计的荧光探针；根据候选序列设计的荧光探针与上下游扩增候选序列所在区域的引物不含发卡结构且引物对不能形成二聚体；上下游扩增候选序列所在区域的引物3'端5bp内G/C碱基不超过两个；根据候选序列设计的荧光探针中的C碱基多于G碱基；和/或候选序列与混伪品及近缘物种的核、叶绿体和线粒体基因组进行比对至少含有2个差异核苷酸；(c)根据候选序列设计的扩增引物GC含量为40％
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60％，且四种核苷酸均匀分布，不存在聚嘌呤及聚嘧啶，不含GC富含区；根据候选序列设计的扩增引物长度为18
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30bp，引物对间相差不超过3个碱基；根据候选序列设计的扩增引物不含反向重复序列以及大于3bp的自互补序列，引物间不能形成二聚体；根据候选序列设计的扩增引物退火温度为55
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60℃，引物对之间的退火温度相差不超过2℃；根据候选序列设计的扩增引物3'端5个碱基中的G/C碱基多于一个但不超过三个；和/或候选序列与混伪品及近缘物种的核、叶绿体和线粒体基因组进行比对至少含有2个差异核苷酸；或者，(d)候选序列所在区域为纯合的；候选序列所在区域的GC含量在30％
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80％；候选序列所在区域不能含有四个以上连续的重复核苷酸；
候选序列所在区域不能含有甲基化序列；候选序列所在区域不能存在发卡结构；和/或候选序列与混伪品及近缘物种的核、叶绿体和线粒体基因组进行比对至少含有2个差异核苷酸；(3)提取待检测中药样品的基因组DNA，任选地对其进行扩增，将所述基因组DNA或其扩增产物作为DNA底物，利用靶标序列检测系统来检测所述DNA底物中是否存在所述标准特异性靶标序列，其中，所述靶标序列检测系统包括CRISPR/Cas12a系统、TaqMan probe
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based real
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time PCR系统、PCR系统或者Sanger测序系统，其中，对于所述CRISPR/Cas12a系统，通过所述检测若产生明显荧光信号，则所述待检测中药样品与指定的中药基原物种具有同一性，反之则没有；对于所述TaqMan probe
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time PCR系统，通过所述检测若CT值大于37，则所述待检测中药样品与指定的中药基原物种具有同一性，反之则没有；对于所述PCR系统中，通过所述检测若电泳结果产生明显条带，则所述待检测中药样品与指定的中药基原物种具有同一性，反之则没有；对于所述Sanger测序系统，若测序结果与所述标准特异性靶标序列相同，则所述待检测中药样品与指定的中药基原物种具有同一性，反之则没有。2.如权利要求1所述的方法，其中，通过构建基因组图谱或浅层测序获得所述中药基原物种的核、叶绿体和线粒体基因组序列；优选地，将所述中药基原物种的核、叶绿体和线粒体基因组序列分成L
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K+1个长度为K的片段，以构成所述小片段基因组文库，并计算每个片段的拷贝数，再通过与基因组比对确定每个片段的基因组位置，其中L表示基因组序列长度，K表示文库片段长度，其中，K为15
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750bp；优选地，所述中药基原物种为掌叶大黄、唐古特大黄或药用大黄；优选地，所述中药基原物种为药用大黄，所述靶标序列检测系统为CRISPR/Cas12a系统，并且所述标准特异性靶标序列包括以SEQ ID NO：1和4示出的靶标核苷酸序列；所述中药基原物种为药用大黄，并且所述靶标序列检测系统为TaqMan probe
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time PCR系统，并且所述标准特异性靶标序列包括以SEQ ID NO：17示出的靶标核苷酸序列；所述中药基原物种为药用大黄，并且所述靶标序列检测系统为PCR系统，并且所述标准特异性靶标序列包括以SEQ ID NO：19示出的靶标核苷酸序列；或者所述中...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋经元，郝利军，许文杰，齐桂红，甘雨桐，辛天怡，
申请(专利权)人：中国医学科学院药用植物研究所，
类型：发明
国别省市：