利用LAMP技术快速检测瓜笄霉的引物组合物及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种利用LAMP技术快速检测瓜笄霉的引物组合物及其检测方法。用于检测瓜笄霉的引物组合物是由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、正向环引物LF、反向环引物LB组成。本发明专利技术根据瓜笄霉的N

【技术实现步骤摘要】
利用LAMP技术快速检测瓜笄霉的引物组合物及其检测方法


[0001]本专利技术属于生物检测领域，涉及一种利用LAMP技术快速检测瓜笄霉的引物组合物及其检测方法。

技术介绍

[0002]瓜笄霉(Choanephora cucurbitarum)属于毛霉门(Mucoromycota)，毛霉纲(Mucoromycetes)，毛霉目(Mucorales)，瓜笄霉科(Choanephoraceae)，瓜笄霉属(Choanephora)。Choanephora cucurbitarum是一种重要的植物病原菌，能侵染瓜类、秋葵、辣椒、冰叶日中花、薄壳山核桃、油菜、西西兰花等多种植物，寄主范围广泛，引起植株湿腐、果腐、花腐、芽枯、叶斑等症状，在受侵染植物生产中造成较重的经济损失。Choanephora cucurbitarum侵染植物体的速度非常快，在温湿度较适宜的情况下，两到三天即可表现症状。
[0003]目前对该病害还没有有效的防治措施，加强检疫、防止病原菌的传播扩散是控制该病的最有效措施。为此应加强监测，建立快速检测方法，为病害的风险及研究决策提供依据，从而有利于降低Choanephora cucurbitarum引起的损失。
[0004]目前，针对Choanephora cucurbitarum的检测技术较少。传统的检测方法主要是应用平板分离法，依据Choanephora cucurbitarum的形态学进行鉴定。该方法耗时耗力，需要丰富和专业的病原菌鉴定经验，而且很难依据形态学特征将Choanephora cucurbitarum与相近种区分开，无法满足田间生产上的需求。随着分子生物学的发展，特别PCR技术的普及，越来越多的分子生物学技术被应用到Choanephora cucurbitarum的检测中。但是这些检测技术往往需要在具有专业仪器、试剂和严格环境条件的实验室中进行，仪器和试剂的价格昂贵且操作要求较高，过程复杂，检测时间仍然较长，不能满足快速检测的需求，不适宜在基层环境中使用推广。
[0005]环介导等温扩增技术(Loop
‑
mediated isothermal amplification，LAMP)是一种基于PCR反应的分子检测技术，该技术应用Bst大片段聚合酶，这种酶具有很强的链置换能力，不需要其它聚合酶的通常需要的模板变性的步骤，使反应能够在等温条件下进行。整个LAMP反应过程在60～65℃进行，反应时间在80min内，简单的加热装置就可以满足反应，极大的降低了反应设备的复杂性与成本，这是LAMP检测技术的一个突出的优点。与传统的PCR不同，LAMP至少需要四对引物，与靶标DNA序列的六个不同区域互补，LAMP反应的最终产物是一系列含有多个靶标序列反向重复序列的茎环DNA和花椰菜结构DNA的混合物。LAMP扩增产物可以利用羟基酚蓝(HNB)的变色与否指示反应结果的阳性或阴性，可通过肉眼观察颜色变化来判定。目前，LAMP技术在等温条件下可以实现靶标DNA特异、高效、快速的扩增，近些年来被广泛应用于医疗卫生、食品安全、海关检疫和农业生产等领域。目前此技术已广泛应用于真菌、细菌、病毒和卵菌的快速检测，但在Choanephora cucurbitarum的检测国内外均未见报道。
[0006]靶标基因的选择是LAMP检测的重要因素之一，目前LAMP检测设计的引物的来源主
要是转录间间隔区(ITS)，但是没有足够多的位点来区分相似种，因此开发出新的检测靶标成为检测的热点。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是针对现有技术中瓜笄霉的生物学检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性差的问题及PCR检测技术需要热循环仪器，无法快速检测瓜笄霉的问题，而提供了一种快速检测瓜笄霉的LAMP检测引物组合物及其分子检测方法，此方法检测周期短、准确性高、灵敏性高、肉眼观察检测结果。本专利技术以N
‑
(5'
‑
phosporibosyl)anthranilate isomerase(PRAI)基因为检测的靶标序列，设计了瓜笄霉的特异性的LAMP引物组合物，在此基础上建立了瓜笄霉的LAMP快速检测方法。
[0008]本专利技术的目的可通过如下技术方案实现：
[0009]特异性检测靶标PRAI在检测瓜笄霉中的应用，所述特异性检测靶标PRAI的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0010]TTCATCCTGAAAGTATCTTGTGTGAAAATGGACATACCATGATTCAAAACTTTTTGAATTTAGAAGGTGGTACCTGGGAAGGAAACCCTGGATCTGGTGTTTTGCCTAAAAAGTTACGTCCTACTCCTCCTCCTCCTGCTACTGCTGAGCCTACTCAAGAAGCCAATACAGGTGCTCCCTCTATCTTGACTCGTATCTATGCTCAACGTGTGAAGGATGTTCAAGCTGCAAAAGAAATAGCTGGTCAAACCATGGAAGATTTGGAAAAGCTTTTGCAACTTCATGTAGCACCTCCACTCCAAGATGTTGTTGCTCGTATTAGACATCAGACACCCGCTCTTTTGGCTGAAGTCAAACGTGCCTCTCCATCCAAAGGTAACATCGATGTCACTG(SEQ ID No.1)。
[0011]检测瓜笄霉的LAMP引物组合物，该引物组合物由以下引物组成:如SEQ ID No.2所示的正向内引物FIP，如SEQ ID No.3所示的反向内引物BIP，如SEQ ID No.4所示的正向外引物F3，如SEQ ID No.5所示的反向外引物B3，如SEQ ID No.6所示的正向环引物LF，如SEQ ID No.7所示的反向环引物LB。
[0012]本专利技术所述的引物组合物在制备瓜笄霉的LAMP检测试剂盒中的应用。
[0013]一种检测瓜笄霉的LAMP试剂盒，含有本专利技术所述的引物组合物。
[0014]所述的检测瓜笄霉的LAMP试剂盒，还包含以下组分：10
×
Thermo Pol Buffer，MgSO4，dNTPs，甜菜碱，BstDNApolymerase，羟基萘酚蓝。
[0015]本专利技术所述的引物组合物或试剂盒在检测瓜笄霉的应用。
[0016]一种瓜笄霉的LAMP检测方法，其特征在于，提取待检微生物DNA，取DNA溶液作为反应模板，加入所述LAMP试剂盒中的检测溶液进行LAMP反应，然后观察扩增产物的颜色变化，若呈天蓝色表示检测结果为阳性，存在瓜笄霉，若呈紫色表示检测结果为阴性，不存在瓜笄霉。
[0017]作为本专利技术的一种优选，所述的LAMP反应体系：2.5μL 10
×
Thermo Pol Buffer，8mmol
·
L
‑1MgSO4，1.2mmol
·
L
‑1dNTPs，内引物FIP和BIP各1.6本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.特异性检测靶标PRAI在检测瓜笄霉中的应用，其特征在于，所述特异性检测靶标PRAI的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。2.检测瓜笄霉的LAMP引物组合物，其特征在于，所述引物组合物由以下引物组成:如SEQ ID No.2所示的正向内引物FIP，如SEQ ID No.3所示的反向内引物BIP，如SEQ ID No.4所示的正向外引物F3，如SEQ ID No.5所示的反向外引物B3，如SEQ ID No.6所示的正向环引物LF，如SEQ ID No.7所示的反向环引物LB。3.权利要求2所述的LAMP引物组合物在制备用于检测瓜笄霉的试剂盒中的应用。4.一种用于检测瓜笄霉的LAMP试剂盒，其特征在于，该试剂盒中包含权利要求2所述的LAMP引物组合物。5.根据权利要求4所述的用于检测瓜笄霉的LAMP试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包含10
×
ThermoPol Buffer、MgSO4、dNTPs、甜菜碱，Bst DNA polymerase、羟基萘酚蓝。6.权利要求2所述的LAMP引物组合物或权利要求4
‑
5所述的LAMP试剂盒在检测瓜笄霉中的应用，所述的检测为非疾病诊断目的的检测。7.一种瓜笄霉的LAMP检测方法，其特征在于，提取待检微生物DNA，取DNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈佳佳，周洪敏，简祖平，于健，郑香容，付丹阳，黄晓潇，李松，孙亚亚，钱江婷，
申请(专利权)人：江苏农林职业技术学院，
类型：发明
国别省市：