可视化运动发酵单胞菌、构建方法及应用技术

本申请涉及运动发酵单胞菌的技术领域，尤其涉及可视化运动发酵单胞菌、构建方法及应用。该可视化运动发酵单胞菌为转入了发色基因eforRed的运动发酵单胞菌ZMNP，所述发色基因eforRed来自于Echinopora forskaliana经过随机突变得到的突变基因。该重组菌株菌株的液体培养液能够呈现肉眼可见的粉色，不需要额外添加昂贵的外源底物即可显色，可以进行活细胞荧光示踪，无光毒性，为实现运动发酵单胞菌基因功能验证及代谢工程改造提供了更加有利的生物元件与监控基础。物元件与监控基础。物元件与监控基础。

【技术实现步骤摘要】
可视化运动发酵单胞菌、构建方法及应用


[0001]本申请涉及运动发酵单胞菌的
，尤其涉及可视化运动发酵单胞菌、构建方法及应用。

技术介绍

[0002]运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)作为一种兼性厌氧革兰氏阴性菌，具有许多独特的生理特点和优异的工业生产特性，是目前唯一已知能够在厌氧条件下利用2
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酮
‑3‑
脱氧
‑6‑
磷酸葡萄糖酸(Entner
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Doudoroff，ED)途径的微生物，具有较高的糖吸收率、乙醇收率和乙醇耐受性等优良特性；近年来被作为纤维素类生物质生物炼制生产生物能源的细胞工厂受到重视天然产乙醇菌株，目前已经在运动发酵单胞菌中实现了乳酸、2
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3丁二醇，异丁醇等产品的生产。
[0003]为实现运动发酵单胞菌在乳酸、2
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3丁二醇，异丁醇等产品的发酵生产中更加利于监控，对运动发酵单胞菌进行基因改造，例如将荧光发色蛋白转入，实现可视化改造，能够在其发酵生产中可视化监控，例如通过监控其色度值大小即可得知其生长情况，十分有利于优势菌株的筛选和发酵过程控制。例如，将荧光蛋白GFP及mCherry已经成功在运动发酵单胞菌中表达，并能检测到高强度荧光信号，发色蛋白作为荧光蛋白的同源物，存在作为运动发酵单胞菌报告基因的可能。如此得到的可视化运动发酵单胞菌更有利于实现对胞内胞外各种目标产物含量的检测，判断菌株是否符合生长预期。
[0004]而传统报告基因由于需要昂贵的外源底物添加、反应灵敏度低及细胞毒性等，逐渐被荧光蛋白报告基因所替代。即便荧光蛋白具有反应灵敏、无需外源添加底物可被激发荧光及无细胞毒性可进行活体示踪等优势，但在检测时仍需要流式细胞仪，荧光酶标仪等仪器激发荧光后通过检测传感器经仪器数据处理，检验过程较复杂。发色蛋白作为荧光蛋白的同源物，由于其强烈的吸收可见光，因此在自然光下便可观察到菌株的明显颜色，省去了复杂的荧光检验流程，具有作为报告基因的潜在优势。

技术实现思路

[0005]本申请实施例将来源于Echinopora forskaliana的发色蛋白基因eforRed经过针对运动发酵单胞菌密码子优化后并于基因尾端整合终止密码子序列TAA命名为ZMforRed，或者对ZMforRed进行随机突变得到的突变体基因ZMeforRed R1整合到质粒pEZ15A中，将得到的重组质粒转入运动发酵单胞菌ZMNP中，如此能够得到可视化运动发酵单胞菌，其菌株的液体培养液能够呈现肉眼可见的粉色，不需要额外添加昂贵的外源底物即可显色，可以进行活细胞荧光示踪，无光毒性，为实现运动发酵单胞菌在乳酸、2
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3丁二醇、异丁醇等产品的发酵生产中提供了更加有利的监控基础。本申请实施例至少提供了如下技术方案：
[0006]第一方面，本申请实施例公开了一种可视化运动发酵单胞菌，所述可视化运动发酵单胞菌为转入了发色基因eforRed的运动发酵单胞菌ZMNP，所述发色基因eforRed来自于Echinopora forskaliana，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或2所示；其中，如SEQ ID NO.2所
ID NO.3～5所示；以及
[0030]将所述重组质粒转入运动发酵单胞菌ZMNP中。
[0031]在一些实施方式中，所述重组质粒的构建步骤包括：
[0032]将来自于Echinopora forskaliana的发色基因eforRed密码子优化后得到目的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
[0033]将启动子与目的基因片段连接成一个长片段；
[0034]将所述长片段与pEZ15A的载体骨架经吉布森装配后反应，转到大肠杆菌DH5α细胞感受态中，提取阳性克隆，即得到所述重组质粒。
[0035]在一个实施例中，启动子为四环素诱导型启动子Ptet，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。将Ptet经过针对运动发酵单胞菌密码子优化后并于基因尾端整合终止密码子序列TAA命名为ZMforRed整合到质粒pEZ15A中，然后利用诱导型启动子Ptet控制基因表达量，得到重组质粒pEZ
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Ptet
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eforRed，将重组质粒转入运动发酵单胞菌ZMNP中，得到具备合成发色蛋白能力的菌株ZM
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Ptet
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eforRed，该菌株能够表达eforRed蛋白。
[0036]在一个实施例中，启动子为运动发酵单胞菌组成型启动子Pgap，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。将Pgap与针对运动发酵单胞菌密码子优化后并于基因尾端整合终止密码子序列TAA命名为ZMforRed的发色基因整合成操纵子，连接至质粒pEZ15A中，得到重组质粒pEZ
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Pgap
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eforRed。将pEZ
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Pgap
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eforRed质粒转入运动发酵单胞菌ZMNP的感受态细胞中，得到菌株ZM
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Pgap
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eforRed，观察显色情况如图1，ZM
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Pgap
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eforRed菌株的液体培养液能够形成粉色。
[0037]本申请实施例提供了一种可视化运动发酵单胞菌的构建方法，包括：
[0038]构建重组质粒，所述重组质粒携带有来自于Echinopora forskaliana的发色基因eforRed和启动子组成的操纵子的突变体，所述突变体中Echinopora forskaliana的发色基因eforRed突变后的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述启动子为运动发酵单胞菌组成型启动子Pgap
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4S，所述Pgap
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4S的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.5所示；以及
[0039]将所述重组质粒转入运动发酵单胞菌ZMNP中。
[0040]在一些实施例中，获得突变体的步骤包括易错PCR突变以构建eforRed突变文库的步骤。
[0041]其中，所述“易错PCR突变以构建eforRed突变文库的步骤”具体包括：
[0042]构建6个易错PCR反应体系和易错PCR反应程序；
[0043]以所述长片段为模板，依次按照所述6个易错PCR反应体系和易错PCR反应程序进行反应，以得到eforRed突变文库。
[0044]在一些实施例中，所述构建方法还包括：
[0045]将所述eforRed突变文库与pEZ15A的载体骨架经吉布森装配后反应，转到大肠杆菌DH5α细胞感受态中，提取阳性克隆，即得到所述重组质粒。
[0046]“易错PCR”是指通过改变PCR反应条件来调整PCR反应中的突变频率，降低聚合酶固有的突变序列的倾向性，提高突变谱的多样性，使得错误碱基随机地以一定的频率掺入到扩增的基因中，从而得到随机突变的DNA群本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可视化运动发酵单胞菌，其特征在于，所述可视化运动发酵单胞菌为转入了发色基因eforRed的运动发酵单胞菌ZMNP，所述发色基因eforRed来自于Echinopora forskaliana，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或2所示；其中，如SEQ ID NO.2所示的基因为如SEQ ID NO.1所示基因的突变基因。2.根据权利要求1所述的可视化运动发酵单胞菌，其特征在于，所述可视化运动发酵单胞菌转入了携带有发色基因eforRed的重组质粒。3.根据权利要求2所述的可视化运动发酵单胞菌，其特征在于，所述重组质粒还携带有启动子，所述启动子选自四环素诱导型启动子Ptet、运动发酵单胞菌组成型启动子Pgap或运动发酵单胞菌组成型启动子Pgap
‑
4S，所述Ptet、所述Pgap和所述Pgap
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4S的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.3～5所示。4.一种可视化运动发酵单胞菌的构建方法，其特征在于，包括：构建重组质粒，所述重组质粒携带有来自于Echinopora forskaliana的发色基因eforRed和启动子组成的操纵子，所述发色基因eforRed的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述启动子选自四环素诱导型启动子Ptet、运动发酵单胞菌组成型启动子Pgap或运动发酵单胞菌组成型启动子Pgap
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4S，所述Ptet、所述Pgap和所述Pgap
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4S的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.3～5所示；以及将所述重组质粒转入运动发酵单胞菌ZMNP中。5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述重组质粒的构建步骤包括：将来自于Echinopora forskaliana的发色基因e...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨世辉，杨宁，杜军，李勉，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：