大斑凸脐蠕孢专化型CAPS标记检测引物、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及大斑凸脐蠕孢专化型CAPS标记检测引物、试剂盒及其应用，属于基因工程及分子生物学技术领域，本研究以Ecp6基因为靶序列，设计特异性的酶切位点，建立了大斑凸脐蠕孢菌玉米和高粱专化型的CAPS标记检测方法，该方法为大斑凸脐蠕孢菌专化型的首个分子检测方法，分子方法的建立将为大量、快速和准确鉴定大斑凸脐蠕孢菌的专化型提供有力支持。定大斑凸脐蠕孢菌的专化型提供有力支持。定大斑凸脐蠕孢菌的专化型提供有力支持。

【技术实现步骤摘要】
大斑凸脐蠕孢专化型CAPS标记检测引物、试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程及分子生物学
，具体涉及大斑凸脐蠕孢专化型CAPS标记检测引物、试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]玉米大斑病是玉米上的一种重要病害，该病害主要为害玉米叶片，发病严重时也可为害玉米的果实、叶鞘以及苞叶等部位，甚至造成整株玉米枯死，从而导致玉米严重减产甚至绝收。玉米大斑病是由大斑凸脐蠕孢菌（Exserohilumturcicum）引起，该菌属于半知菌类凸脐蠕孢属，不仅可以侵染玉米，还可以侵染高粱，引起高粱大斑病。交叉接种试验显示大斑凸脐蠕孢菌具有高度的寄主专化性，从玉米上分离的大斑凸脐蠕孢菌不能侵染高粱，而从高粱上分离的大斑凸脐蠕孢菌也不能侵染玉米，因此通常被分为大斑凸脐蠕孢玉米专化型和高粱专化型。这2种专化型菌株仅仅在致病性上发生分化，在形态上没有任何差别，在生物学特性上也没有明显差异。因此大斑凸脐蠕孢菌的专化型测定只能通过传统的鉴别寄主叶片接种的方法来进行，该方法需要种植玉米和高粱，费时费力，表型不明显时还难以判断结果，需要多次重复试验进行验证。

技术实现思路

[0003]为了解决现有大斑凸脐蠕孢玉米专化型和高粱专化型测定中的不足，本专利技术的目的一在于提供一种大斑凸脐蠕孢专化型CAPS标记检测引物，目的二在于提供上述检测引物在大斑凸脐蠕孢专化型检测或制备大斑凸脐蠕孢专化型检测试剂中的应用，目的三在于提供一种大斑凸脐蠕孢专化型检测试剂盒，目的四在于提供一种基于CAPS标记技术检测大斑凸脐蠕孢专化型的方法。本申请以Ecp6基因为靶序列，设计了特异性的酶切位点，成功建立了大斑凸脐蠕孢菌玉米和高粱专化型的CAPS标记检测方法。
[0004]为了实现上述目的，本专利技术采用的具体方案为：第一方面，一种大斑凸脐蠕孢专化型CAPS标记检测引物，所述检测引物是以Ecp6为靶标基因，包括核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的DBEC
‑
F引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的DBEC
‑
R引物。
[0005]优选地，所述大斑凸脐蠕孢专化型是指大斑凸脐蠕孢玉米专化型和高粱专化型。
[0006]第二方面，上述检测引物在大斑凸脐蠕孢专化型检测或制备大斑凸脐蠕孢专化型检测试剂中的应用。
[0007]第三方面，一种大斑凸脐蠕孢专化型检测试剂盒，包含上述检测引物。
[0008]第四方面，一种基于CAPS标记技术检测大斑凸脐蠕孢专化型的方法，包括以下步骤：步骤一、DNA提取：分离并培养大斑凸脐蠕孢菌，收集菌丝，提取DNA；步骤二、以步骤一提取的DNA为模板，采用通用引物对DBEC
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F/DBEC
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R进行PCR扩增；所述DBEC
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F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述DBEC
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO：
2所示；步骤三、使用限制性内切酶BmgBI对步骤二的PCR扩增产物进行酶切，对酶切结果进行分析：若为一条带，则为玉米专化型菌株；若为两条带，则为高粱专化型菌株。
[0009]作为对上述方法的进一步优化，步骤二中，采用通用引物对DBEC
‑
F/DBEC
‑
R扩增的片段长度为920bp。更进一步地，步骤三中，使用限制性内切酶BmgBI酶切后，若扩增产物未被酶切，仍是一个920bp的条带，则为玉米专化型菌株；若扩增产物被酶切成260bp和660bp的两条带，则为高粱专化型菌株。
[0010]有益效果：本研究以Ecp6基因为靶序列，设计特异性的酶切位点，建立了大斑凸脐蠕孢菌玉米和高粱专化型的CAPS标记检测方法，该方法为大斑凸脐蠕孢菌专化型的首个分子检测方法，分子方法的建立将为大量、快速和准确鉴定大斑凸脐蠕孢菌的专化型提供有力支持。
附图说明
[0011]图1是靶标基因Ecp6 2种等位基因的序列比对图；其中，Ecp6(Et28A)为参考基因组Et28A的Ecp6基因序列，圆点代表与参考序列一致，不一致时为替换核苷酸。
[0012]图2是2种不同等位基因菌株的PCR产物酶切结果图；其中，A：BmgBI酶切前的电泳图；B:BmgBI酶切后的电泳图。
[0013]图3是60株大斑凸脐蠕孢菌PCR产物的酶切结果图。
具体实施方式
[0014]采用简单、快速的分子生物学方法进行病原菌专化型的测定是一种趋势，目前大斑凸脐蠕孢菌的全基因组测序已经完成，在此基础上申请人又对30个玉米专化型菌株和30个高粱专化型菌株进行了全基因组重测序，通过全基因组关联分析鉴定到多个与寄主来源表型完全共分离的的基因。虽然大斑刚毛座腔菌寄主专化性的分子机制尚未阐明，但是这些鉴定的基因为采用分子生物学的方法来鉴定大斑凸脐蠕孢菌专化型提供了基础。本研究以Ecp6基因为靶序列，设计特异性的酶切位点，建立了大斑凸脐蠕孢菌玉米和高粱专化型的CAPS标记检测方法，该方法为大斑凸脐蠕孢菌专化型的首个分子检测方法，分子方法的建立将为大量、快速和准确鉴定大斑凸脐蠕孢菌的专化型提供有力支持。
[0015]下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述。
[0016]1材料与方法1.1供试菌株和培养基供试菌株共60株，均为2019年从河南、山西和陕西三省采集的发病玉米和高粱叶片，通过组织分离和单孢分离获得纯的大斑凸脐蠕孢菌株（见表1），转接于PDA斜面上12℃下保存。
[0017]表1 本研究所使用的大斑凸脐蠕孢菌。菌株编号专化型采集地点基因型菌株编号专化型采集地点基因型HAC01玉米河南省Ecp6(I)HAS01高粱河南省Ecp6(II)HAC03玉米河南省Ecp6(I)HAS02高粱河南省Ecp6(II)HAC06玉米河南省Ecp6(I)HAS04高粱河南省Ecp6(II)
HAC10玉米河南省Ecp6(I)HAS06高粱河南省Ecp6(II)HAC12玉米河南省Ecp6(I)HAS09高粱河南省Ecp6(II)HAC13玉米河南省Ecp6(I)HAS19高粱河南省Ecp6(II)HAC22玉米河南省Ecp6(I)HAS21高粱河南省Ecp6(II)HAC26玉米河南省Ecp6(I)HAS26高粱河南省Ecp6(II)HAC30玉米河南省Ecp6(I)HAS32高粱河南省Ecp6(II)HAC33玉米河南省Ecp6(I)HAS36高粱河南省Ecp6(II)SNC01玉米陕西省Ecp6(I)SNS01高粱陕西省Ecp6(II)SNC07玉米陕西省Ecp6(I)SNS02高粱陕西省Ecp6(II)SNC11玉米陕西省Ecp6(I)SNS03高粱陕西省Ecp6(II)SNC13玉米陕西省Ecp6(I)SNS13高粱陕西省Ecp6(II)SNC17玉米陕西省Ecp6(I)SNS16高粱陕西省Ecp6(II)SNC18玉米陕西省Ecp6(I)SNS20高粱陕西省Ecp6(II)SNC23玉米陕西省Ecp6(I)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大斑凸脐蠕孢专化型CAPS标记检测引物，其特征在于：所述检测引物是以Ecp6为靶标基因，包括核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的DBEC
‑
F引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的DBEC
‑
R引物。2.根据权利要求1所述的检测引物，其特征在于：所述大斑凸脐蠕孢专化型是指大斑凸脐蠕孢玉米专化型和高粱专化型。3.根据权利要求1或2所述的检测引物在大斑凸脐蠕孢专化型检测中的应用。4.根据权利要求1或2所述的检测引物在制备大斑凸脐蠕孢专化型检测试剂中的应用。5.一种大斑凸脐蠕孢专化型检测试剂盒，包含权利要求1或2所述的检测引物。6.一种基于CAPS标记技术检测大斑凸脐蠕孢专化型的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一、DNA提取：分离并培养大斑凸脐蠕孢菌，收集菌丝，提取DNA；步骤二、以步骤一提取的DNA为模板，采用通用引物对DBEC

【专利技术属性】
技术研发人员：胡艳红，任明阳，程婧璇，李梦琪，李芳功，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：