降血糖药物疗效检测制造技术

本发明专利技术公开了一种检测个体降血糖药物疗效的试剂盒。该试剂盒包括检测降血糖药物用药靶向位点ＣＹＰ２Ｃ９基因和ＣＹＰ２Ｃ１９基因多态性位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、荧光定量ＰＣＲ常规组件等。本发明专利技术的试剂盒通过检测降血糖药物用药靶向位点ＣＹＰ２Ｃ９基因和ＣＹＰ２Ｃ１９基因多态性位点来评估个体降血糖药物疗效。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本专利技术涉及一种检测个体降血糖 药物疗效的试剂盒，通过检测降血糖药物用药靶向位点CYP2C9基因和CYP2C19基因多态性 位点来评估个体降血糖药物疗效。
技术介绍
糖尿病是一种与胰岛素产生和作用异常相关，以高血糖症为主要特征的代谢性疾 病，包括以胰岛素绝对缺乏为主的1型糖尿病(T1DM)及以胰岛素相对缺乏和胰岛素抵抗为 主的2型糖尿病(T2DM)两种类型。目前，糖尿病在世界范围内已成为继心脑血管疾病、肿 瘤之后严重危害人类健康的第三大慢性病。我国糖尿病人群的构成以2型糖尿病为主，占 糖尿病人群的90%以上。糖尿病治疗的目标是控制高血糖，纠正代谢紊乱，防止和延缓并发症。主要治疗手 段为使用胰岛素治疗，口服降血糖药物治疗，以及胰腺移植和胰岛细胞移植。对于口服降血 糖药物来说，其药效往往因人而异，受药物代谢酶影响较大。然而，随着人们对药代学、药效 学和药物基因组学的深入了解和把握，使得通过更加灵敏、有效的基因检测手段来预测药 物疗效和规避不良反应成为可能。CYP450基因存在多态性，部分多态导致酶活性降低或失去活性，从而影响对药物 的代谢水平。其中CYP2C9和CYP2C19基因编码的酶在部分口服降血糖药物的代谢过程中 发挥着重要的作用。迄今已在CYP2C9基因的编码区和非编码区发现了 33种单核苷酸多态性(SNP)， 依次被编为*2 *34号，*1定义为无突变的野生型。研究较多主要是CYP2C9*2 *6五 种多态性，且其中最重要的是*2 (Argl44Cys,又表示为C416T)和*3 (Ile359Leu,又表示为 A42614C)两种。上述突变的发生频率具种族差异。CYP2C9底物的体内代谢与其基因型相关。在日本人和英国人中发现CYP2C9*3的 杂合子病人所需华法林的平均剂量为*1野生型的60%，而*3纯合子病人的剂量仅为*1野 生型的10%，即正常人的剂量为4 8mg/d，而CYP2C9*3纯合子仅需0. 4mg/d。CYP2C9*2 同样存在类似现象，杂合子和突变纯合子分别降低15 20%和40%。而且，携带CYP2C9*2 和*3的病人应用华法林时发生出血并发症等不良反应和国际标准化比率(INR，一种抗凝 作用指标)增高(>4.0)的概率显著高于正常人。在土耳其人和日本人中发现*2和*3 杂合子个体服用苯妥因后12小时血药浓度比正常人高30%，而有*3纯合子个体的苯妥因 体内口服清除率降低79%。CYP2C9*3纯合子个体对甲苯磺丁脲和格列吡嗪的体内口服清 除率较正常人低80%，或者其半衰期延长3 4倍。虽然CYP2C9*2等位基因对酶活性的影响很大，仅小于*3，但是研究发现该等位基 因在中国人中出现的频率非常低，几乎为零。因此，对于中国人来说，CYP2C9基因多态性对 药物代谢的影响主要来自于*3等位基因。对CYP2C19催化代谢的药物，在人群中可表现为2种代谢型，一种为强代谢型(extensive metabolizer，EM)，另一种为弱代谢型(poor metabolizer，PM)。多数人一般表 现为强代谢，弱代谢则主要是由于2个等位基因的突变和(或)缺失引起的。PM发生率存 在着明显种族差异，白种人和非洲黑人中PM发生率为2% 4%，东方人高达13% 23%。 在一个大样本量的研究中，中国人CYP2C19的PM所占的比例为14%，也就是有1.8亿人为 PM.
技术实现思路
基于降血糖药物用药靶向位点CYP2C9基因和CYP2C19基因多态性可用来评估个 体降血糖药物疗效的基础上，本专利技术提供一种检测个体降血糖药物疗效的试剂盒。该试剂盒包括检测降血糖药物用药靶向位点CYP2C9基因和CYP2C19基因多态性位点的特异性 引物对及特异性荧光探针对；荧光定量PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反应缓冲液、去离 子水等)。本试剂盒中所述的特异性荧光探针对是能够轻易完成设计的，特异性荧光探针对 可用常规的探针合成技术进行合成。本专利技术试剂盒的组分和含量包括10X荧光定量PCR反应缓冲液2 ill，25mM dNTP 混合液 0. 2u 1,25mM MgC12 溶液 1. 2ii 1，5units/ u 1 Taq DNA 聚合酶 0. 05 u 1,20iiM特异性引物对每条引物各0. 225 iil，10 uM特异性荧光探针对每条探针各0. 25 ill，去离子水 10. 65ii 1。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。 具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。下列实施例中未注明具体条件的实验 方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。实施例检测试剂盒的使用步骤1:DNA模板的抽取用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。步骤2 荧光定量PCR反应使用检测试剂盒中的荧光定量PCR套装，进行2次独立的荧光定量PCR反应，每次 反应的体系为总体积lOyl，包含浓度为20ng/iil的DNA模板2iil、lia 10X荧光定量PCR 反应缓冲液、0. 1 u 1 25mM dNTP 混合液、0. 6 u 1 25mM MgCl2 溶液、0. 025 u 1 (5units/ u 1) Taq DNA聚合酶、20 u M的有义引物和反义引物各0. 225 yl、10 y M的带VIC荧光探针和带 FAM荧光探针各0. 25 ill，去离子水5. 325 ii 1。在PCR扩增仪上进行反应 反应条件为50°C、2分钟，95°C、10分钟，进行60个循环的95°C、30秒，60°C、1分钟。反应结束后在荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。步骤4 基因型分析根据试剂盒使用说明书标示的基因分型图示对SNP位点进行基因型分析。熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示 的最终样品荧光量，根据不同序列探针荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因 型。权利要求一种检测个体降血糖药物疗效的试剂盒，其特征在于包括检测降血糖药物用药靶向位点CYP2C9基因和CYP2C19基因多态性位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括 IOX荧光定量PCR反应缓冲液2 μ 1，.25mM dNTP 混合液 0. 2 μ 1，.25mM MgCl2 溶液 1. 2 μ 1，.5units/ μ 1 Taq DNA 聚合酶 0. 05 μ 1，.20 μ M特异性引物对每条引物各0. 225 μ 1，.10 μ M特异性荧光探针对每条探针各0. 25 μ 1，去离子水10. 65 μ I0本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。全文摘要本专利技术公开了一种检测个体降血糖药物疗效的试剂盒。该试剂盒包括检测降血糖药物用药靶向位点CYP2C9基因和CYP2C19基因多态性位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、荧光定量PCR常规组件等。本专利技术的试剂盒通过检测降血糖药物用药靶向位点CYP2C9基因和CYP2C19基因多态性位点来评估个体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测个体降血糖药物疗效的试剂盒，其特征在于：包括检测降血糖药物用药靶向位点ＣＹＰ２Ｃ９基因和ＣＹＰ２Ｃ１９基因多态性位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Ｔａｑ酶、ｄＮＴＰ混合液、ＭｇＣｌ↓［２］溶液、荧光定量ＰＣＲ反应缓冲液、去离子水。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：冯哲民，邹祖烨，
申请(专利权)人：上海主健生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]