一种mRNA-LNP中提取游离mRNA的方法及其包封率的测定方法技术

本发明专利技术属于核酸纯化和提取领域，更具体涉及从mRNA

【技术实现步骤摘要】
一种mRNA
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LNP中提取游离mRNA的方法及其包封率的测定方法


[0001]本专利技术属于核酸纯化和提取领域，更具体涉及从mRNA
‑
LNP中提取游离mRNA的方法及其包封率的测定方法。

技术介绍

[0002]核酸药物可以通过调控靶蛋白表达应用于蛋白质相关疾病的治疗。从上世纪60年代初发现mRNA开始，经过几十年的发展后，mRNA治疗策略终于显示出临床效益，已有多款核酸药物在全球获批上市。然而，核酸药物递送载体的开发，始终是业界公认的核心壁垒和技术难点之一。
[0003]通过脂质纳米颗粒对核酸进行包裹并递送至目标区域是目前常用的核酸给药手段。正常情况下，mRNA
‑
LNP体系中大部分mRNA被包封在脂质体内部，小部分以游离状态存在。mRNA
‑
LNP的包封率是指包封于脂质纳米颗粒内部的mRNA占全部mRNA的比例，是评价脂质纳米颗粒性质的重要指标。包封率的测定方法一般是先通过一定的方法(如柱层析法、透析法、超速离心法等)把未包封的游离药物与脂质纳米粒分离，并分别进行测定后计算得出。
[0004]在现有技术中，核酸脂质纳米颗粒(Lipid nanoparticles，LNP)的包封率通常通过RiboGreen法进行测定，RiboGreen是一种用于定量检测溶液中RNA含量的超敏感荧光核酸染料，当RiboGreen荧光染料处于溶液状态时，几乎没有荧光活性，与RNA结合时，其荧光活性将增加1000倍，因此可通过荧光光谱测定核酸的含量。在RiboGreen法中，在不对包封后的核酸和游离的核酸进行分离的条件下，直接对总的样本进行测定，由于被包裹在脂质颗粒中的mRNA无法被测出，因此可以直接测定得到游离的核酸量；随后通过表面活性剂对脂质纳米颗粒进行破乳处理，裂解脂质纳米颗粒释放出包封的核酸，再次测定得到总的核酸量，通过上述二者计算得到核酸的包封率。
[0005]然而，当RNA片段大小在500bp—9kb范围时，RiboGreen测试荧光强度和片段大小无关，这导致RiboGreen还会结合样品中的杂质，如其它RNA和DNA，在一些应用场景中会导致结果出现偏差。另外，随着核酸药物设计的多样化发展，出现了需要同时递送两种以上mRNA的LNP，RiboGreen法不能同时对多种mRNA的包封率进行检测，也对其使用造成了限制。
[0006]目前存在多种对生物样品中mRNA进行分离提取的技术手段，但在含LNP的体系中，由于mRNA
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LNP结构的不稳定性，在受到外部因素(如提取过程中的机械力、电磁力等)影响时，包裹于LNP中的mRNA易于发生泄露。这使得很多分离方法难以适用于分离LNP体系中的游离mRNA。

技术实现思路

[0007]针对现有技术的缺陷或需求，本专利技术人研究发现使用羧酸磁珠可以成功地从含LNP体系中提取游离的mRNA，该过程不会对mRNA
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LNP结构产生破坏，且易于操作。同时，对mRNA的高效液相色谱法的参数进行了大量的研究，得到较优的测定参数和条件。进一步将
羧酸磁珠从含mRNA
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LNP体系中提取游离的mRNA的方法与高效液相色谱法结合后，不仅能更准确地测定mRNA
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LNP的包封率，还可同时测定多mRNA
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LNP的包封率，由此完成本专利技术。
[0008]本专利技术提供一种mRNA
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LNP中提取游离mRNA的方法，其包括采用羧酸磁珠从含mRNA
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LNP体系中提取游离的mRNA的步骤。优选地，将mRNA
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LNP体系与羧基磁珠于800
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1200rpm振摇下作用20
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60分钟。更优选地，将mRNA
‑
LNP体系与羧基磁珠于1000rpm振摇下作用30分钟。
[0009]在一个具体实施方式中，测定前羧基磁珠的处理：充分混匀磁珠，置于磁力架上至溶液完全透明，移去上清液；更具体地，采用涡旋并置于滚轴混匀仪上室温滚动混匀，吸取磁珠浓度5
‑
15mg/ml混匀状态下的磁珠溶液至无酶离心管中；离心管置于磁力架上至溶液完全透明，移去上清液。
[0010]在另一个具体实施方式中，游离mRNA的提取：在移去了上清液的磁珠中，加入mRNA
‑
LNP溶液，充分混匀；加入RNA binding buffer，轻柔吸打混匀；置于加热振荡器上，室温旋转孵育；置于磁力架上至溶液清澈透明，移去上清液；加入DEPC水配制的乙醇溶液，涡旋混匀磁珠；置于磁力架上至溶液清澈透明，移去上清液后，进行干燥；移去磁力架，加入DEPC水，涡旋混匀磁珠并置于振荡器上室温孵育；涡旋并置于磁力架上直至溶液清澈透明；收集含游离mRNA的上清液。
[0011]更优选地，置于振荡器上室温孵育是指置于振荡器上室温800
‑
1200rpm孵育3
‑
10min。
[0012]所述方法还包括进一步测定最后得到上清液中的mRNA浓度的步骤；优选地，采用HPLC的方法进行测定。
[0013]进一步优选地，采用DNAPac
TM
RP色谱柱，流动相A为六氟异丙醇、三乙胺的水溶液；流动相B为六氟异丙醇、三乙胺的甲醇溶液；更具体地，流动相A配制：取六氟异丙醇21.06ml，三乙胺1.04ml，加水477.9ml，混匀；流动相B配制：取六氟异丙醇21.06ml，三乙胺1.04ml，加甲醇477.9ml，混匀。
[0014]其中测定中，液相的流速为0.4ml/min，检测波长为260nm，柱温为75℃，样品室温度为8℃，洗针溶剂为50％甲醇。洗脱程序如下：
[0015]时间
‑
min流动相A
‑
％流动相B
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％0802018020666341966342159529595308020388020
[0016]本专利技术提供一种测定mRNA
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LNP的包封率的方法，其通过所述的方法提取制备的mRNA
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LNP中的游离mRNA，并测定其含量，结合mRNA
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LNP中总mRNA的含量来计算得到mRNA
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LNP的包封率。
[0017]优选地，包封率计算方法如下：
[0018]游离mRNA浓度：
[0019][0020]总mRNA浓度：
[0021][0022]包封率：EE％＝(C
t
‑
C
f
)/C
t
；
[0023]其中：
[0024]C
t
为样品溶液中总mRNA的浓度，μg/ml；
[0025]C
f
为样品溶液中游离mRNA的浓度，μg/ml；
[0026]A
t
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种mRNA
‑
LNP中提取游离mRNA的方法，其特征在于，包括采用羧酸磁珠从含mRNA
‑
LNP体系中提取游离mRNA的步骤。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将mRNA
‑
LNP体系与羧基磁珠于800
‑
1200rpm振摇下作用20
‑
60分钟。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，将mRNA
‑
LNP体系与羧基磁珠于1000rpm振摇下作用30分钟。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，测定前羧基磁珠的处理：充分混匀磁珠，置于磁力架上至溶液完全透明，移去上清液；更具体地，采用涡旋并置于滚轴混匀仪上室温滚动混匀，吸取磁珠浓度5
‑
15mg/ml混匀状态下的磁珠溶液至无酶离心管中；离心管置于磁力架上至溶液完全透明，移去上清液。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，游离mRNA的提取步骤：在移去了上清液的磁珠中，加入mRNA
‑
LNP溶液，充分混匀；加入RNA结合缓冲液，轻柔吸打混匀；置于加热振荡器上，室温旋转孵育；置于磁力架上至溶液清澈透明，移去上清液；加入DEPC水配制的乙醇溶液，涡旋混匀磁珠；置于磁力架上至溶液清澈透明，移去上清液后，进行干燥；移去磁力架，加入DEPC水，涡旋混匀磁珠并置于振荡器上室温孵育；涡旋并置于磁力架上直至溶液清澈透明；收集含游离mRNA的上清液；更优选地，置于振荡器上室温孵育是指置于振荡器上室温800
‑
1200rpm孵育3
‑
10min。6.如权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于，还包括进一步测定最后得到上清液中的mRNA浓度的步骤；优选地，采用HPLC的方法进行测定。7.如权利要求6所述方法，其特征在于，采用DNAPac
TM
RP色谱柱，流动相A为六...

【专利技术属性】
技术研发人员：白效静，李深正，王永毅，范康梅，曾旭，
申请(专利权)人：杭州剂泰医药科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：