一种提取血浆游离DNA的试剂盒、制备方法及提取方法技术

本发明专利技术涉及一种提取血浆游离DNA的试剂盒、制备方法及提取方法，包括：1．蛋白酶K：血浆样本中与蛋白酶K的质量/体积比为5：1

【技术实现步骤摘要】
一种提取血浆游离DNA的试剂盒、制备方法及提取方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及了一种提取血浆游离DNA的试剂盒、制备方法及提取方法。

技术介绍

[0002]游离DNA(cell
‑
free DNA，cfDNA)是一种血液或体液中游离于细胞之外的DNA。1947年，Mandel和Metais首次报道了外周血中存在cfDNA。生理情况下，血液中的cfDNA主要来源于白细胞的坏死和凋亡，在某些疾病和特殊状态下，其他细胞也会释放游离DNA进入血浆，包括来源于肿瘤细胞的循环肿瘤DNA(Circulating tumor DNA，ctDNA)，来源于胎儿的cfDNA等。1994年，Vasioukhin等和Sorenson等在急性髓性淋巴瘤、骨髓增生异常综合征和胰腺癌患者外周血ctDNA中发现了RAS基因的突变，表明可以利用ctDNA发现肿瘤的特异性基因突变。随着新的研究结果的不断出现，cfDNA用于疾病早期诊断、预后评估、疗效监测等方面的潜在价值越来越受到关注。检测血浆或血清中cfDNA可视为一种"液体活检"，有利于开展各种相关诊断，并能避免有创的组织活检。以血液为检测标本，使重复采集检测样本成为了可能，从而有利于对疾病的发展及肿瘤的治疗过程进行跟踪监测。
[0003]目前cfDNA检测对方法学要求极高，虽然目前cfDNA的检测方法都具有很高的敏感度和特异度，但是仍存在一些和传统病理学或细胞遗传学检测结果不一致的情况。由于血浆中存在的靶cfDNA微乎其微，标本的采集、抗凝剂使用和保存的不当都会影响检测的质量，造成假阳性或假阴性的结果所以，优化提取和检测的方法，进一步提高检测cfDNA方法的灵敏度和特异性，缩短检测的时间，降低检测的成本，同时实现检测方法之间的标准化，都是亟待解决的问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种提取血浆游离DNA的试剂盒、制备方法及提取方法技术，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0006]第一方面，本专利技术提供一种粪便样本DNA核酸提取试剂盒，试剂盒主要包括以下组分：蛋白酶K、裂解缓冲液、结合缓冲液、漂洗缓冲液1、漂洗缓冲液2、洗脱缓冲液。
[0007]蛋白酶K：
[0008]蛋白酶K属于丝氨酸蛋白酶SB超家族中的S8家族，由一条肽链组成，具有很高的切割活性，底物识别位点能和底物组成一个3股的反平行β片层，可催化脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键断裂。此酶经纯化去除了RNA酶和DNA酶活性。蛋白酶K在pH 4
‑
12.5较广的pH范围内均有活性，作用温度范围为37
‑
65℃。
[0009]蛋白酶K血浆样本中与蛋白酶K的质量/体积比为5：1
‑
10：1，蛋白酶K的浓度范围为10mg/mL
‑
30mg/mL。
[0010]优选的，待处理样本与蛋白酶K的体积比为10：1，所述蛋白酶K的浓度范围为20mg/
mL。
[0011]裂解缓冲液：
[0012]裂解缓冲液包括：1
‑
4.5M异硫氰酸胍、1
‑
6mM EDTA、20
‑
150mM Tris
‑
HCl、0.05％
‑
20％NP40，pH为4
‑
6。
[0013]优选的，裂解缓冲液中的成分含量为：4M异硫氰酸胍，6mM EDTA，100mM Tris
‑
HCl，10％ NP40，裂解液的pH为5.5。
[0014]本专利技术提供的裂解缓冲液在裂解血浆样本时，使样品中的核酸游离在裂解体系中，促进核酸与蛋白分离，从而释放核酸。
[0015]具体原理介绍如下：
[0016]异硫氰酸胍：白色结晶性粉末，异硫氰酸胍是一类强力的蛋白质变性剂，无RNA酶和DNA酶活性。在核酸提取中，异硫氰酸胍能够迅速破碎细胞或病毒释放核酸，抑制细胞释放出的核酸酶，保证核酸一级结构的完整性。
[0017]EDTA：即乙二胺四乙酸，其能够与Mg2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+等金属离子结合，可防止金属离子激活蛋白酶，从而减少金属离子对核酸质量的影响。
[0018]Tris
‑
HCl：有助于在细胞裂解和提取过程中保持pH稳定，维持核酸磷酸基团与硅胶膜的带电状态，利氢键的保持，防止核酸被破坏。
[0019]NP40：是一种温和的非离子型去垢剂，1％浓度基本可以破坏掉细胞膜，而对核膜的破坏作用较弱，结合特定的缓冲液可以获得胞浆蛋白。与蛋白结合力强，用于防止物质分子疏水间相互作用，确保蛋白的充分溶解和结构稳定。尤其用于膜蛋白的非变性条件下的溶解从而释放核酸。
[0020]结合缓冲液
[0021]结合缓冲液，包括：1
‑
4M异硫氰酸胍、1
‑
3M盐酸胍、20
‑
150mM Tris
‑
HCl、1
‑
6mM EDTA、0.05％
‑
30％ Tween20、10％
‑
30％ PEG 8000、10％
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35％异丙醇，pH为4
‑
8。
[0022]优选的，结合缓冲液中的成分含量为：4M异硫氰酸胍，2M盐酸胍，100m Tris
‑
HCl，4mMEDTA，0.10％Tween20，10％PEG 8000，30％异丙醇，其pH为7.5。
[0023]具体原理介绍如下：
[0024]盐酸胍：是核酸酶的强抑制剂，但并不是强变性剂，它在核酸提取中的主要作用是使蛋白质变性并抑制酶活性。盐酸胍能够快速破坏细胞膜，使得蛋白质变性沉淀，从而让核酸能够摆脱蛋白质的缠绕。
[0025]Tween20(吐温)：为非离子型表面活性剂，用来破坏细胞膜(裂解细胞)以释放细胞内的可溶性物质。它们可以破坏蛋白质
‑
蛋白质、蛋白质
‑
脂质、脂质
‑
脂质之间的连接，使蛋白质发生结构上的变性，去除与核酸相互作用的蛋白质。
[0026]PEG 8000(聚氧乙烯8000)：在空气中易发生氧化降解，需尽量避免将其暴露在空气和或高温环境，活化后可以结合多肽或蛋白质，用于沉淀蛋白，原理是通过空间位置排斥，使蛋白质被迫集聚在—起而引起沉淀的发生。
[0027]异丙醇：能够夺取RNA/DNA周围的水分，因此RNA/DNA能够聚集而发生沉淀。
[0028]漂洗缓冲液1
[0029]漂洗缓冲液1，包括：1
‑
3M盐酸胍、20
‑
150mM Tris
‑
HCl、0.05％
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30％ Tween20、10％
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35％无水乙醇，pH为5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
rpm离心1分钟，收集DNA溶液，
...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛丰，殷剑峰，王春香，
申请(专利权)人：江苏康为世纪生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：