一种利用噬菌体展示文库筛选β-乳球蛋白特异性结合多肽方法技术

本发明专利技术涉及一种利用噬菌体展示文库筛选与β

【技术实现步骤摘要】
一种利用噬菌体展示文库筛选
β
‑
乳球蛋白特异性结合多肽方法


[0001]本专利技术涉及食品检测领域，具体涉及一种筛选β
‑
乳球蛋白特异性结合多肽的方法。

技术介绍

[0002]牛乳是国际食品法典委员会(CAC)确定的八大类食物过敏原之一，由其引起的过敏反应常见于婴幼儿中，发病时可累及周身多个系统，严重时可导致过敏性休克乃至危及生命。在牛乳过敏人群中，82％的过敏患者对牛乳β
‑
乳球蛋白过敏。
[0003]多年来，β
‑
乳球蛋白作为主要的致敏牛奶蛋白一直受到研究者的关注，其分子由162个氨基酸残基组成，分子量为18.4kDa，主要以二聚体形式存在，它的高度结构化促成了耐酸和耐蛋白酶水解的特性，经过人体消化后依然存在完整的β
‑
乳球蛋白及肽段，引发过敏反应。因此，β
‑
乳球蛋白可以作为一种检测食品中是否含牛乳蛋白的一种有效标志物。为了使牛乳过敏患者尽量避免接触牛乳中的过敏原，对β
‑
乳球蛋白的检测尤为关键，筛选β
‑
乳球蛋白特异性结合多肽对于其快速精准检测具有重要意义。
[0004]噬菌体展示文库技术目前已经发展成为一种发现新特性以及改变已有多肽性质的强大工具，它操作简单、成本相对较低，具有10
12
‑
13
超大库容量，更容易筛选到与目标物质匹配的多肽序列。目前为止，还未见关于利用噬菌体展示文库技术筛选与β
‑
乳球蛋白特异性结合的多肽报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术目的在于提供一种与β
‑
乳球蛋白特异性结合的肽段及其筛选方法。
[0006]针对上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]本专利技术的第一方面提供一种利用噬菌体展示文库筛选与β
‑
乳球蛋白特异性结合多肽的方法，该方法包括以下步骤：
[0008](一)将ER2738菌株活化培养后，在扩大培养的宿主菌中加入梯度稀释的噬菌体，获得重组噬菌体文库；
[0009](二)以β
‑
乳球蛋白为诱饵对随机12肽库进行3轮淘选，对结合的目标噬菌体扩增，并用
‑
96gIII测序引物测序，翻译后获得与β
‑
乳球蛋白特异性结合的多肽；
[0010](三)合成步骤(二)获得的多肽，通过间接竞争ELISA法验证多肽与β
‑
乳球蛋白亲和力以及多肽与不同蛋白的结合特异性，筛选出对β
‑
乳球蛋白特异性识别的多肽。
[0011]优选的，所述步骤(一)包含以下步骤：
[0012]ER2738菌株接种到LB
‑
Tet培养基中，过夜活化培养；将单菌落接种到LB
‑
Tet培养基中，过夜培养至OD
600
为0.4
‑
0.6；按照10倍梯度稀释法，用LB培养基稀释噬菌体，按照需求将扩大培养的宿主菌均分后，每管中分别加入经过稀释的梯度噬菌体，混合后孵育；将经过感染的宿主菌涂板于平板中，过夜培养；挑取独立噬菌斑，接种于琼脂平板中，过夜培养；将
过夜培养物加入到LB液体培养基中，震荡培养；将上述培养物高速离心，收集上清，加入PEG/NaCl溶液，混匀后静置过夜；将上述溶液在高速离心后收集沉淀物，加入无菌PBS溶液重新悬浮，即为扩增的噬菌体培养物。
[0013]更优选的，所述步骤(一)包含以下步骤：
[0014](1)ER2738菌株接种到LB
‑
Tet培养基中，过夜活化培养；将单菌落接种到LB
‑
Tet培养基中，过夜培养至OD
600
为0.4
‑
0.6；
[0015](2)IPTG和Xgal溶解于DMF待用；在LB培养基中添加琼脂，同时加入IPTG/Xgal储存液制备平板，冷却凝固后备用；
[0016](3)按照10倍梯度稀释法，用LB培养基稀释噬菌体，按照需求将扩大培养的宿主菌均分后，每管中分别加入经过稀释的梯度噬菌体，混合后孵育；
[0017](4)将步骤(3)中经过感染的宿主菌涂板于步骤(2)中准备的平板中；过夜培养，第二天对噬菌斑计数，并计算M13K07噬菌体的滴度；
[0018](5)挑取独立噬菌斑，接种于琼脂平板中，过夜培养；
[0019](6)将过夜培养物加入到LB液体培养基中，震荡培养；
[0020](7)将上述培养物高速离心，收集上清，加入上清液体积1/5的PEG/NaCl溶液，混匀后静置过夜；
[0021](8)将上述溶液在高速离心后收集沉淀物，加入无菌PBS溶液重新悬浮，即为扩增的噬菌体培养物；
[0022](9)取扩增的噬菌体培养物测定滴度，剩余溶液保存备用。
[0023]进一步优选的，所述步骤(一)包含以下步骤：
[0024](1)ER2738菌株接种到LB
‑
Tet培养基中，37℃过夜活化培养；将单菌落按照1:100比例接种到5mL LB
‑
Tet培养基中，37℃过夜培养至OD
600
达到0.4
‑
0.6；
[0025](2)准备琼脂平板：称取1.25g IPTG和1g Xgal溶解于25mLDMF储存于
‑
20℃待用；在1L LB培养基中添加15g琼脂，同时加入1mL IPTG/Xgal储存液制备平板，室温冷却待其凝固后，储存于4℃避光备用；
[0026](3)按照10倍梯度稀释法，用LB培养基稀释噬菌体，按照需求将扩大培养的宿主菌均分后，每管中分别加入10μL经过稀释的梯度噬菌体，轻轻混合后室温孵育30min；
[0027](4)将步骤(3)中经过感染的宿主菌涂板于步骤(2)中准备的平板中；37℃过夜培养，第二天对噬菌斑计数，并计算M13K07噬菌体的滴度；所述滴度测定方法：按照1:100的稀释比例，将1μl噬菌体稀释于100μl LB液体培养基中，连续稀释为6个浓度梯度后，分别加入900μl处于对数期的ER2738菌液，置于37℃下培养30min，涂布于预热的LB
‑
Tet平板上，37℃倒置过夜培养；对蓝斑计数，计算噬菌体滴度；
[0028](5)挑取独立噬菌斑，接种于琼脂平板中，置于37℃下过夜培养；
[0029](6)将500μL过夜培养物加入到50mL LB液体培养基中，置于37℃下，200rpm震荡培养3
‑
6h；
[0030](7)将上述培养物高速离心，8000rpm、20min，收集上清，加入上清液体积1/5的PEG/NaCl溶液，多次上下颠倒混匀后，4℃下静置过夜；
[0031](8)将上述溶液在4℃下离心，8000rpm高速离心20min后，收集沉淀物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用噬菌体展示文库筛选与β
‑
乳球蛋白特异性结合多肽的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(一)将ER2738菌株活化培养后，在扩大培养的宿主菌中加入梯度稀释的噬菌体，获得重组噬菌体文库；(二)以β
‑
乳球蛋白为诱饵对随机12肽库进行3轮淘选，对结合的目标噬菌体扩增，并用
‑
96gIII测序引物测序，翻译后获得与β
‑
乳球蛋白特异性结合的多肽；(三)合成步骤(二)获得的多肽，通过间接竞争ELISA法验证多肽与β
‑
乳球蛋白亲和力以及多肽与不同蛋白的结合特异性，筛选出对β
‑
乳球蛋白特异性识别的多肽。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(一)包含以下步骤：ER2738菌株接种到LB
‑
Tet培养基中，过夜活化培养；将单菌落接种到LB
‑
Tet培养基中，过夜培养至OD
600
为0.4
‑
0.6；按照10倍梯度稀释法，用LB培养基稀释噬菌体，按照需求将扩大培养的宿主菌均分后，每管中分别加入经过稀释的梯度噬菌体，混合后孵育；将经过感染的宿主菌涂板于平板中，过夜培养；挑取独立噬菌斑，接种于琼脂平板中，过夜培养；将过夜培养物加入到LB液体培养基中，震荡培养；将上述培养物高速离心，收集上清，加入PEG/NaCl溶液，混匀后静置过夜；将上述溶液在高速离心后收集沉淀物，加入无菌PBS溶液重新悬浮，即为扩增的噬菌体培养物。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(二)包含以下步骤：将β
‑
乳球蛋白标准品用PBS缓冲液稀释，取96孔酶标板，包被过夜；弃去包被液，加入明胶溶液封闭；取步骤(一)制备的噬菌体溶液，用明胶溶液稀释，加入酶标板孵育；弃去噬菌体样品，加入三乙胺后静置，吸出洗脱液迅速用Tris
‑
HCl中和；测定洗脱液中重组噬菌体的滴度；浓缩纯化噬菌体粒子，用于下一轮筛选；重复步骤上述两次，完成三轮淘选；阳性噬菌体克隆测序，将测序结果翻译为氨基酸序列。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(二)中获得的多肽包括FNSDSRSTHQED、NTACDMSGRHCH、EIRLSDSPTSGL、SDAWKISTITTM、EVEASSQSPEFY、GFPVPTKEGNRH、QSMAYYVWYADF、YPTGIVSYDDTM、ATTSAELSNEKL、MNTEIETMNSRK和SMPRLWDNTSNT...

【专利技术属性】
技术研发人员：于宁，陈颖，杨艳，张九凯，邓婷婷，邢冉冉，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：