一种基于Tn5转座子的链特异性单链DNA高通量测序方法技术

本发明专利技术公开了一种基于Tn5转座子切割标记单链DNA的基础上开发的链特异性高通量测序方法，包括利用Tn5转座子可以切割单链DNA并标记5

【技术实现步骤摘要】
一种基于Tn5转座子的链特异性单链DNA高通量测序方法


[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及一种基于Tn5转座子的链特异性单链DNA高通量测序方法。

技术介绍

[0002]高通量测序技术被广泛应用于生命科学研究中，是基因组学分析，表观遗传信息分析，染色质结构分析等多种组学研究的必要手段和方法。在使用高通量测序技术时，我们通常在目标DNA的5
’
和3
’
两端连接上含特定DNA序列的接头。通过含接头序列的PCR引物进行DNA扩增，得到可用于高通量测序的测序文库。
[0003]自Tn5转座子在大肠杆菌中被发现以来，多被用于切割并标记双链DNA。研究者利用Tn5转座酶在双链DNA两端连接不同的DNA接头，用于直接PCR扩增，从而构建测序文库。此功能已应用于多种高通量测序方法，例如研究蛋白质
‑
DNA互作关系的CUT&Tag。
[0004]然而，如何将Tn5转座子应用于单链DNA测序，是现阶段仍未实现的目标。针对以上问题，以下提出一种解决方案。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种基于Tn5转座子的链特异性单链DNA高通量测序方法，首次提出并使用了Tn5转座子切割并标记ssDNA的功能，所得文库具有链特异性，且建库方法操作便捷。
[0006]本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
[0007]以单链DNA(ssDNA)为例，本链特异性高通量测序方法的整体流程为：/>[0008](1)将Tn5转座酶与接头AdapterB组装形成单一接头的转座子Tn5
‑
B，用于切割ssDNA，并同时在ssDNA的5
’
端加上接头AdapterB，纯化含接头DNA并片段化的ssDNA。
[0009](3)设计特定序列的双链DNA接头AdapterA。接头AdapterA由两条寡居核酸退火组装而成，其中一条链5
’
端增加磷酸化修饰；另一条互补链的3
’
端增加6个随机碱基，并且在6个随机碱基外的3
’
端再添加一个反向dT碱基，以防止错误延伸。以上条件保证了接头AdapterA与目的ssDNA的3
’
端连接。
[0010](4)通过T4 DNA连接酶，将5
’
端含有接头AdapterB的单链DNA(5
’‑
AdapterB
‑
ssDNA)与接头AdapterA连接起来，得到双端特异性接头的片段化DNA模板(5
’‑
AdapterB
‑
ssDNA
‑
AdapterA
‑3’
)。
[0011](5)使用与接头AdapterA和AdapterB相匹配的引物对含双端接头的ssDNA进行PCR扩增，得到链特异性的文库，用于高通量测序。
[0012]与现有的应用于链特异性的测序技术相比，本专利技术具有如下优势：
[0013](1)本专利技术首次提出并使用了Tn5转座子切割单链DNA。
[0014](2)本专利技术可适用于单链DNA链特异性测序。
[0015](3)建库方法操作便捷，节约文库制备的时间。
[0016]本专利技术提供了一种基于Tn5转座子切割并标记单链DNA的基础上，开发的具有链特异性的单链DNA高通量测序方法。本专利技术基于专利技术人首次发现Tn5转座子具有切割单链DNA的功能，专利技术并设计了可连接在3
’
端的DNA接头，构建了从Tn5切割单链DNA，到连接DNA接头，最后PCR扩增得到链特异性的测序文库的全部流程。该方法可应用于单链DNA测等多种组学高通量测序。
附图说明
[0017]图1为本专利技术的具体实施流程图；
[0018]图2为单链DNA测序实例的链特异性图。
具体实施方式
[0019]以下所述仅是本专利技术的优选实施方式，保护范围并不仅局限于该实施例，凡属于本专利技术思路下的技术方案应当属于本专利技术的保护范围。
[0020](一)单一接头Tn5
‑
B转座子制备：
[0021](1)转座子单接头AdaperB由由两条寡核苷酸链退火聚合而成。取1μl 100μM Tn5b(序列：5
’‑
GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG
‑3’
)，与等量的1μl 100μM 5
’
端磷酸化引物Tn5rev(序列：5
’‑
[phos]CTGTCTCTTATACACATCT
‑3’
)，8μl H2O混合体系退火杂交，在95℃反应5min后以0.1℃/min的速度降至25℃，退火得到的10μl接头AdapterB；
[0022](2)用20μl接头AdapterB与70μl Tn5转座酶蛋白(浓度为0.5mg/ml)于室温混合反应1h得到单一接头的Tn5
‑
B转座子。
[0023](二)3
’
端连接接头AdapterA制备：
[0024](1)3
’
端连接接头AdapterA由两条寡核苷酸链退火聚合而成。取2μl 100μM 5
’
端磷酸化引物5ph_Tn5a(序列：5
’‑
[phos]CTGTCTCTTATACACATCTGACGCTGCCGACGA
‑3’
)，与等量的2μl100μM的，与Tn5a互补且含特殊修饰的寡核苷酸Tn5a_N6_invert_dT(序列：5
’‑
TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNN[invert dT]‑3’
)，16μl H2O混合体系退火杂交，在95℃反应5min后以0.1℃/min的速度降至25℃，退火得到的20μl含修饰的双链DNA接头AdapterA；
[0025](2)在得到的双链DNA接头AdapterA的20μl体系中加入1μl核酸外切酶EXO I，3μl 10Xbuffer，6μl H2O，共30μl体系，37℃孵育2小时，去除没有反应完的寡聚核酸，使用60μl DNA纯化磁珠纯化接头AdapterA。
[0026](三)测序文库构建：
[0027](1)单链DNA片段化，5
’
端DNA接头连接：将14μl目标单链DNA，与4μl 5X DMF buffer(50％ DMF,50mM Tris
‑
HCl pH 7.5,10mM MgCl2)，2μl转座子Tn5
‑
B充分混合，37℃反应5min，加入Stop buffer(1.5μl 0.5M EDTA,1.8μl 10％ SDS,and 0.5μl 20mg/ml Proteinase K)，55℃反应3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于Tn5转座子的链特异性单链DNA高通量测序方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)使用单一接头的Tn5转座子切割ssDNA链，并且在ssDNA链的5
’
端插入特定DNA接头，获得片段化的单链ssDNA；(2)在单链ssDNA的3
’
端通过T4 DNA连接酶连接上特定设计的双链DNA接头；(3)通过使用含特定DNA接头序列的引物，PCR扩增得到具有链特异性的文库，并测序。2.根据权利要求1所述的一种基于Tn5转座子的链特异性单链DNA高通量测序方法，其特征在于，所述步骤(1)中的单一接头的Tn5转座子为Tn5转座酶与接头AdapterB组装形成单一接头的转座子Tn5
‑
B，所述步骤(2)中的特定DNA接头为AdapterA，所述AdapterA用于连接单链DNA的3
’
端。3.根据权利要求1所述的一种基于Tn5转座子的链特异性单链DNA高通量测序方法，其特征在于，所述步骤(2)中特定设计的双链DNA接头为特定序列的双链DNA接头AdapterA，所述接头AdapterA由两条寡居核酸退火组装而成，其中一条链5
’
端增加磷酸化修饰；另一条互补链的3
’
端增加6个随机碱基，并且在6个随机碱基外的3
’
端再添加一个反向dT碱基，以防止错误延伸。4.根据权利要求1所述的一种基于Tn5转座子的链特异性单链DNA高通量测序方法，其特征在于，所述步骤(2)中T4 DNA连接酶用于将5
’

【专利技术属性】
技术研发人员：方东，张燕君，
申请(专利权)人：浙江大学绍兴研究院，
类型：发明
国别省市：