基于金纳米簇电致化学发光猝灭传感器的制备方法及其应用技术

本发明专利技术属miRNA检测技术领域，涉及一种基于金纳米簇电致化学发光猝灭传感器的制备方法，包括：将含有底物DNA、辅助DNA和阻断DNA的混合物缓慢加热至95℃保持5min，冷却至25℃保持2h，得到三链DNA；将10μL浓度为2.5mg/mL的ATT

【技术实现步骤摘要】
基于金纳米簇电致化学发光猝灭传感器的制备方法及其应用


[0001]本专利技术属于miRNA检测
，涉及传感器，尤其涉及一种基于金纳米簇电致化学发光猝灭传感器的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]电化学发光(ECL)具有操作简便、灵敏度高、信号背景低等优点，已被广泛用于早期疾病诊断、临床分析、食品安全、DNA分析等方面，是强大的生物分析技术。ECL发光物质的发光效率和核酸扩增策略会在很大程度上影响ECL方法测定miRNA的灵敏度。为了进一步提高生物传感器的性能，最近越来越多的研究集中在设计新型发光材料或传统的发光衍生物作为ECL的发射物质，如半导体量子点、碳纳米材料、金属复合物和聚合物点等。尽管这些材料极大地提高了ECL的发光效率，但所用的ECL试剂具有较强毒性，因此，开发一种具有高发光效率、高稳定性和低毒性的ECL试剂非常重要。
[0003]配体保护的金纳米聚集体是最近流行的ECL发光体。由于具有良好的生物相容性和小尺寸的优势，包括牛血清蛋白(BSA)、I
‑
蛋氨酸(Met)和谷胱甘肽(GSH)等配体，这些配体所包覆的金纳米团的ECL强度相对较弱，发光不稳定。特别是6
‑
aza
‑2‑
thiopyrimidine(ATT)配体包覆的Au NCs，通过简单地在电极表面干燥，发现其ECL信号增强了1200倍，并且具有优异的AIE性能和良好的固态稳定性。所制备的ATT
‑
Au NCs在电极上具有良好的成膜能力，并具有强大而稳定的ECL强度。
[0004]电化学发光共振能量转移(RET)是一种有效的方法，它通过将能量从供体转移到受体来提高ECL的信号和效率。Cu2O是一种无毒的p型半导体，在紫外可见光的波长范围内具有很高的吸收系数，Cu2O的紫外可见光谱与ATT
‑
Au NCs的ECL发射光谱有效重叠。合成的Cu2O NPs的平均尺寸为8nm
±
2nm，Cu2O NPs的小颗粒尺寸得益于与DNA的有效结合。
[0005]本专利技术利用ATT
‑
Au NCs和Cu2O之间的共振能量转移(RET)制备出了"开
‑
关"型生物传感器。

技术实现思路

[0006]针对上述现有技术中存在的不足，本专利技术的第一个目的是公开一种基于金纳米簇电致化学发光猝灭传感器的制备方法。
[0007]技术方案
[0008]一种基于金纳米簇电致化学发光猝灭传感器的制备方法，包括如下步骤：
[0009]A、将含有底物2.0μM DNA(ST)、2.5μM辅助DNA(AS)和2.5μM阻断DNA
[0010](BK)的混合物缓慢加热至95℃保持5min，冷却至25℃保持2h，得到三链DNA(tsDNA)；
[0011]B、将10μL浓度为2.5mg/mL的ATT
‑
Au NCs滴到裸露的经预处理后的玻碳电极GCE表面，50℃干燥；
[0012]C、滴加10μL的tsDNA滴在上述玻碳电极表面进行改性，4℃孵育过夜；
[0013]D、改性后的电极表面滴加10μL己烷硫醇，静置40min后用PBS冲洗，以便阻断非特异性吸附位点，制得基于金纳米簇电致化学发光猝灭传感器的制备方法。
[0014]本专利技术较优公开例，步骤B中所述经预处理后的玻碳电极GCE，先以50nmα
‑
氧化铝抛光粉抛光再用乙醇和超纯水超声清洗干净，再以电化学方法对电极进行表面清洗。
[0015]进一步的，所述电化学方法清洗，设定扫描范围为0～1.5V，将玻碳电极置于1M的硫酸溶液中得到稳定的循环伏安峰曲线，然后将电极表面用二次水冲洗干净，氮气吹干备用。
[0016]本专利技术较优公开例，步骤B中所述的ATT
‑
Au NCs，其制备包括：将1.7mL浓度0.08M的ATT(6
‑
氮杂
‑2‑
硫代胸腺嘧啶)，其中的NaOH浓度0.2M，添加到2mL的HAuCl4溶液中，混合充分后，30℃避光搅拌1h，离心(10000rpm,20min)纯化，冷冻干燥过夜，即得。
[0017]其中，所述HAuCl4溶液的浓度为10mg/mL。
[0018]本专利技术较优公开例，步骤D中所述己烷硫醇的浓度为1.0mM，溶剂为乙醇。
[0019]本专利技术的第二个目的，在于公开了上述基于金纳米簇电致化学发光猝灭传感器应用于miRNA的含量检测。
[0020]本专利技术以待检测的miRNA为miRNA
‑
21作为实例，公开如下步骤：
[0021](1)将1μM HP1和1μM HP2缓慢加热至95℃保持5min，冷却到25℃保温2h，以形成稳定的发夹结构；
[0022](2)分别取上述2μL HP1、2μL HP2、不同浓度的目标物miRNA
‑
21和4.0
[0023]μL Cu2O
‑
NH2/L1猝灭探针混合，在基于金纳米簇电致化学发光猝灭传感器表面孵育70min，构建生物传感器，以其为工作电极、Pt电极为对电极、甘汞电极为参比电极，组建三电极体系，发光仪电位调整为0～1.45V，扫描速率调整为100mV/s，在含0.093mM三乙胺TEA的磷酸盐缓冲溶液PBS中测量，绘制不同浓度目标物miRNA
‑
21对应的ECL信号响应图作为标准工作曲线；
[0024](3)待测的含miRNA
‑
21样品按照步骤(2)相同工序进行处理，置于含有0.093mM TEA的PBS溶液里检测ECL信号值，对照标准工作曲线可得待测样品miRNA
‑
21的浓度值。
[0025]本专利技术较优公开例，步骤(2)与(3)中所述磷酸盐缓冲溶液PBS的pH值为7.4。
[0026]本专利技术较优公开例，步骤(3)中待测含miRNA
‑
21样品的检测线性范围为10
‑
15
～10
‑7M,检测限为0.28fM。
[0027]本专利技术较优公开例，步骤(2)中，所述Cu2O
‑
NH2/L1猝灭探针，其制备方法包括如下步骤：
[0028](A)将0.045g Cu2O分散在含45μL的3
‑
氨基丙基三乙氧基硅烷的10mL乙醇中，70℃搅拌1.5h，冷却至室温，得到氨基功能化Cu2O NPs(Cu2O
‑
[0029]NH2)溶液；
[0030](B)将8.0μL 0.1μM的1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)加入190μL浓度为10μM的L1链中搅拌均匀得混合溶液；
[0031](C)将混合溶液和2.0μL 0.1μM的N
‑
羟琥珀酰亚胺(NHS)加入到本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于金纳米簇电致化学发光猝灭传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：A、将含有底物2.0μM DNA(ST)、2.5μM辅助DNA(AS)和2.5μM阻断DNA(BK)的混合物缓慢加热至95℃保持5min，冷却至25℃保持2h，得到三链DNA(tsDNA)；B、将10μL浓度为2.5mg/mL的ATT
‑
Au NCs滴到裸露的经预处理后的玻碳电极GCE表面，50℃干燥；C、滴加10μL的tsDNA滴在上述玻碳电极表面进行改性，4℃孵育过夜；D、改性后的电极表面滴加10μL己烷硫醇，静置40min后用PBS冲洗，以便阻断非特异性吸附位点，即得。2.根据权利要求1所述的基于金纳米簇电致化学发光猝灭传感器的制备方法，其特征在于：步骤B中所述经预处理后的玻碳电极GCE，先以50nmα
‑
氧化铝抛光粉抛光再用乙醇和超纯水超声清洗干净，再以电化学方法对电极进行表面清洗。3.根据权利要求2所述的基于金纳米簇电致化学发光猝灭传感器的制备方法，其特征在于：步骤B中所述电化学方法清洗，设定扫描范围为0～1.5V，将玻碳电极置于1M的硫酸溶液中得到稳定的循环伏安峰曲线，然后将电极表面用二次水冲洗干净，氮气吹干备用。4.根据权利要求1所述的基于金纳米簇电致化学发光猝灭传感器的制备方法，其特征在于，步骤B中所述的ATT
‑
Au NCs，其制备包括：将1.7mL浓度0.08M的ATT(6
‑
氮杂
‑2‑
硫代胸腺嘧啶)，其中的NaOH浓度0.2M，添加到2mL的HAuCl4溶液中，混合充分后，30℃避光搅拌1h，离心纯化，冷冻干燥过夜，即得。5.根据权利要求4所述的基于金纳米簇电致化学发光猝灭传感器的制备方法，其特征在于：所述HAuCl4溶液的浓度为10mg/mL。6.根据权利要求1所述的基于金纳米簇电致化学发光猝灭传感器的制备方法，其特征在于：步骤D中所...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱家万，陈传祥，王银珠，王玲玲，董莹，
申请(专利权)人：江苏科技大学，
类型：发明
国别省市：