一种基于CRISPR/Cas12a检测SARS-CoV-2S1的适配体传感器制造技术

本发明专利技术提供了一种基于CRISPR/Cas12a检测SARS

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR/Cas12a检测SARS
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CoV
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2 S1的适配体传感器


[0001]本专利技术属于医学检验
，具体涉及一种检测SARS
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CoV
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2 S1蛋白的电化学适配体传感器。

技术介绍

[0002]目前针对新型冠状病毒（SARS
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CoV
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2）的检测方法是实时逆转录酶聚合酶链检测方法（rRT
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PCR）。这种方法的优是时间短，一次可检测多个样品，成本低。但也存在需要专业仪器和人员，对操作的精准度以及实验室的条件要求高等问题；并且目前病毒变异速度快，急需开发一个具有普适性，且方便操作，能够实现原位，及时，定量检测的方法。
[0003]SARS
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CoV
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2具有一个单一的RNA基因组，编码四种主要蛋白质：刺突(S)、膜(M)、包膜(E)和核衣壳(N)蛋白。特别是S蛋白参与宿主细胞感染过程，S蛋白N端S1片段在受体结合的过程中发挥作用，C端S2片段在病毒感染过程中促进膜融合S1的受体结合域(RBD)与血管紧张素转换酶2(ACE2)的相互作用介导了SARS
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CoV
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2进入人体细胞的过程。并且现在突变体的出现，大多发生在S蛋白，从而可能造成传播力的增强。因此，S蛋白是疫苗和药物开发以及早期诊断的关键靶点。
[0004]聚类规则间隔短回文重复序列(CRISPR)相关系统(Cas)的出现为基因编辑领域提供了前所未有的新思路，新技术。CRISPR/Cas12a系统是其中一种高效的生物传感器开发工具，在识别到目标核酸的时候，可以发挥其反式切割作用，对体系中单链核苷酸进行剪切。CRISPR/Cas12a系统的独特优势已经在核酸相关检测中得到广泛的应用，但目前在蛋白检测领域的检测受到限制。而核酸适配体可以很好地搭起非核酸靶标和CRISPR/Cas12a之间的桥梁，拓宽其检测目标的范围。
[0005]核酸适配体（aptamer）是指通过指数富集的配基系统进化技术（SELEX）筛选分离得到的寡核苷酸序列，长度约为25
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80个碱基，具有与单克隆抗体相匹敌的特定靶分子结合的能力，且相对于抗体而言，生产成本低。由于其各种优势，包括储存寿命长、批间差异小、免疫原性极低，生物利用度高、低免疫原性和体积小等显著的优势。此外，这些适配体分子很容易被各种材料进行化学修饰，从而可以广泛应用到肿瘤的治疗，生物传感器的构建等领域。在SARS
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CoV
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2检测和治疗领域，适配体都发挥着其独特的优势，目前整合适配体和CRISPR/Cas12a以及电化学进行病毒关键蛋白的检测鲜有报道。

技术实现思路

[0006]针对现有技术中检测耗时长、成本高、操作繁琐等问题，本专利技术提供针对新型冠状病毒（SARS
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CoV
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2）刺突蛋白（spike protein）进行检测的电化学传感器，检测速度快，检测限低，特异性高。
[0007]本专利技术另一目的在于提供上述核酸适配体传感器的制备方法。
[0008]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案。
[0009]一种基于CRISPR/Cas12a检测SARS
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CoV
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2 S1蛋白的电化学适配体传感器，包括：
SARS
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CoV
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2 S1蛋白适配体，CRISPR/Cas12a蛋白，crRNA，表面修饰多聚腺苷酸
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亚甲基蓝的金电极；所述SARS
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CoV
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2 S1蛋白适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述多聚腺苷酸
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亚甲基蓝的结构为(A)7CCC
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MB，其中，A表示腺苷酸，C表示胞苷酸，MB表示亚甲基蓝。
[0010]所述SARS
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CoV
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2 S1蛋白的包含如SEQ ID NO:3
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6所示的任一氨基酸序列。
[0011]优选地，所述CRISPR/Cas12a蛋白和crRNA的摩尔比为2:1
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1:2。
[0012]优选地，所述表面修饰多聚腺苷酸
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亚甲基蓝的金电极的制备方法，包括以下步骤：（a）将金电极按照由粗到细的顺序在氧化铝浆中抛光至镜面，获得抛光的金电极；（b）将多聚腺苷酸
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亚甲基蓝的溶液在抛光的金电极上孵育，获得表面修饰多聚腺苷酸
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亚甲基蓝的金电极。
[0013]优选地，所述电化学适配体传感器还包括参比电极和对电极。进一步地，所述金电极，金电极和参比电极，金电极、参比电极和对电极还可以分别以单电极、双电极或三电极型丝网印刷电极代替。
[0014]上述电化学适配体传感器可用于制备检测SARS
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CoV
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2的试剂盒。
[0015]优选地，所述试剂盒还包括缓冲液和/或SARS
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CoV
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2 S1蛋白。
[0016]所述SARS
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CoV
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2的毒株为野生型，德尔塔、贝塔或奥密克戎变异株。
[0017]一种上述电化学适配体传感器或试剂盒检测SARS
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CoV
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2的方法，包括以下步骤：（1）将SARS
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CoV
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2 S1蛋白适配体和待测样品孵育获得混合溶液；（2）将CRISPR/Cas12a蛋白和crRNA在溶液中孵育，获得CRISPR/Cas12a
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crRNA二元复合物的溶液；（3）将（1）和（2）获得的溶液混合均匀后孵育，获得检测液；（4）将检测液滴加到修饰多聚腺苷酸
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亚甲基蓝的金电极上孵育后冲洗，采用差分脉冲伏安法测量ΔI。
[0018]优选地，步骤（4）中，孵育的温度为25
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37
˚
C，孵育的时间为5
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20 min。
[0019]优选地，差分脉冲伏安法的测量参数为：电位设置0~
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0.5 V，脉冲宽度0.05 V，扫描速率为0.06 s。
[0020]本专利技术机理如图1所示：本专利技术的电化学传感器基于核酸适配体作为识别元件，CRISPR/Cas12a和PolyA
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MB修饰的电极作为转换元件。
[0021]本专利技术中一共用到了3条寡核苷酸链：SARS
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CoV
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2 S1蛋白适配体（Apt
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S1
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79s）：GTCTTGCGGGGCG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR/Cas12a检测SARS
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CoV
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2 S1蛋白的电化学适配体传感器，其特征在于，包括：SARS
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CoV
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2 S1蛋白适配体，CRISPR/Cas12a蛋白，crRNA，表面修饰多聚腺苷酸
‑
亚甲基蓝的金电极；所述SARS
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CoV
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2 S1蛋白适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述多聚腺苷酸
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亚甲基蓝的结构为(A)7CCC
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MB，其中，A表示腺苷酸，C表示胞苷酸，MB表示亚甲基蓝。2.根据权利要求1所述的电化学适配体传感器，其特征在于，所述SARS
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CoV
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2 S1蛋白的包含如SEQ ID NO:3
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6所示的任一氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的电化学适配体传感器，其特征在于，所述CRISPR/Cas12a蛋白和crRNA的摩尔比为2:1
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1:2。4.根据权利要求1所述的电化学适配体传感器，其特征在于，所述电化学适配体传感器还包括参比电极和对电极。5.根据权利要求4所述的电化学适配体传感器，其特征在于，所述金电极，金电极和参比电极，金电极、参比电极和对电极分别以单电极、双电极或三电极型丝网印刷电极代替。6.一种包含如权利要求1
...

【专利技术属性】
技术研发人员：张立云，邢文萍，李倩，韩聪，张铮，方晓娜，罗昭锋，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：