蝴蝶兰光周期相关基因PhalCOL的序列及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种蝴蝶兰光周期相关基因ＰｈａｌＣＯＬ的序列及其应用，旨在提供一种ＰｈａｌＣＯＬ基因、以及含有该基因的重组植物表达载体、含有重组植物表达载体的植物细胞系和植物转化体，以及该基因在促进植物营养生长和缩短开花时间中的应用和应用原位杂交检测ＰｈａｌＣＯＬ基因在蝴蝶兰植株组织中表达分布的方法。本发明专利技术的ＰｈａｌＣＯＬ基因是从蝴蝶兰中克隆出来的，其全长共９８７ｂｐ，编码３２８个氨基酸残基的蛋白，实验发现该基因能够影响植株的发育，促进植物营养生长和生殖生长，缩短开花时间。该基因为基因工程改良植物的生长进程，对植物的花期进行调控提供了有效的技术手段，具有广泛的应用前景和极大的经济价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学、基因工程
，具体涉及一种在蝴蝶兰中表达的，与光周期相关的CONSTANS-like基因一P/w/CO丄基因、含有该基闲的重组植物表达载体、含有上述重组植物表达载体的转基因植物转化体，以及尸/^/09￡基因在促进植物生长发育上的应用，还有应用原位杂交检测Pto/CO丄基因在蝴蝶兰植株组织中表达分布的方法。
技术介绍
日照长度(即光周期)是影响开花时间的主要因素之一。拟南芥是一种典型的长日照植物，长日照能促进拟南芥开花，而短曰照则会抑制开花。目前的研究发现，光周期途径中的主要调控基因有CONSTANS (CO)， CRY2/FHA， GIGANTEA(GI)， FT禾卩FWA，它们的突变体在长日照(LD)条件下延迟开花，但在短日照(SD)条件下开花时间与野生型相似。C(9是植物光周期信号传导途径中的关键基因，在光受体和生物钟的共同调控下，基因表达量在一天之内呈节律性变化。Putterill等最早于1995年在拟南芥中找到一个比野生型开花延迟的突变体，然后采用图位克隆的方法分离到了 CO基因，该基因在根和叶中表达，在长日照下CO促使拟南芥丌花，但是短日照条件下不起作用。后来，Yano等在水稻中克隆到拟南芥的CO同源基因//A ， //ZW突变后水稻对光周期的敏感性降低。CO蛋白是一个转录因子，它不是决定植物开花的最终产物，而是通过调控下游基因和S(9C7的表达控制开花时间。超表达CO基因后，W和仰C7的表达量增加，开花时间提前，但是在KT突变体中超表达co基因效果并不明显，'说明co是依赖于Fr来调控植物开花时间。co位于生物钟输出途径，在生物钟和开花时间之间起着纽带作用。蝴蝶兰是兰科植物中栽培最广泛、最受欢迎的种类之一，花形似蝴蝶，别致美丽、色彩艳丽，花期长达数月之久，观赏价值极高，在热带兰中素有"兰花皇后"之美誉，国内外一直视其为花中珍品，倍受人们青睐。在我国，蝴蝶兰消费主要集中在春节、中秋、国庆、元旦等重大节日，生产上确保蝴蝶兰如期上市非常重要，花期调控是生产中的关键环节之一。影响蝴蝶兰生长发育与开花的因子有肥料、基质、温度、光照、激素等，生产上主要通过调控这几个因子来实现对蝴蝶兰的花期调控。光照是影响蝴蝶兰花芽分化、花梗生长乃至开花的重要因素。Kubota等表明，冷处理中给以适当光照可诱导兰花产生花芽，完全黑暗下无花芽产生。曾爱平认为在一定的范围内，光照越强，抽梗率越大、花梗生长越快、花朵数越多、始花期越早；在蝴蝶兰栽培中特别是3花芽分化期要给予充足的光照，否则抽梗率降低、花梗伸长缓慢、花期延迟。Vaz等研究指出在蝴蝶兰生长期间每天给予20h或更长的光照时间会严重影响其花芽分化，抑制开花并縮短蝴蝶兰的寿命。因此，在兰花的花期调节中应适时的给予适当的光照才能保证正常花芽的分化和开花，甚至提早开花。但光照影响蝴蝶兰开花的分子机理尚无报道。
技术实现思路
-本专利技术的第一目的是提供了一种在蝴蝶兰中表达的，与光周期相关的CONSTANS-like基因一P/w/C(9i:基因、以及含有该基因的重组植物表达载体、含有上述重组植物表达载体的植物细胞系和植物转化体。本专利技术的第二个目的是提供基因在促进植物营养生长和縮短开花时间中的应用。本专利技术的第三个目的是提供了应用原位杂交检测/^0/09丄基因在蝴蝶兰植株组织中表达分布的方法。本专利技术以蝴蝶兰杂交种"婚宴，，CP/ a/ae"o^" /^6n'cfa cv. Wedding Promenade)的花芽为材料，提取其总RNA，再将mRNA逆转录成cDNA第一链，以该cDNA第一链模板，根据尸/w/C0L基因保守区域设计引物进行PCR扩增，获得572bp的核心片段，根据RACE方法，设计引物，PCR扩增获得5'端和3'端序列，最后拼接获得全长cDNA序列，该cDNA序列长度为1202bp，其序列如SEQ ID NO.l所示，其开放阅读框为自5，端第15位至第1001位碱基，共987bp，将此开放阅读框命名为P/^/CO丄基因，其编码的蛋白的氨基酸序列具有328个氨基酸残基，其序列如SEQ ID N0.2所示，将该蛋白命名为PhalCOL。将蝴蝶兰的/^a/C<9￡基因编码的蛋白质序列用ClustalW2分析其同源性，结果显示尸/w/C(9Z基因具有两个保守的B-box-type锌指域和一个CCT域，它分别和大麦的COL具有49%的同源性，和水稻/W/具有45%同源性，和拟南芥的JZCO丄4具有46%的同源性，AC(9丄3具有45%的同源性以及力Q9有36%的同源性。本专利技术人将上述尸to/CO丄基因与植物表达载体连接，通过农杆菌介导，将含有尸/z"/CO丄基因的重组植物表达载体转化到烟草的叶片中，经组织培养成含有/^"/09丄基因的转基因烟草。通过实验发现，该转基因烟草与野生型烟草相比，转基因烟草前期营养生长更旺盛，长得更快些，在开花时间上，转基因植株都比野生型烟草提前开花，10个转化株的平均开花时间为41天，而野生型的平均开花时间为65天。由此表明，外源/^37a^基因为具有功能的结构基因，其在宿主烟草中实现了超量表达，促进了转基因烟草的营养生长和生殖生长，从而縮短了开花时间，因此该基因能影响植株的发育。从上述结果分析可以表明，本专利技术的尸/w/CO丄基因是一个新的与光周期相关的CCWS7^VS-like基因，该基因能促进植物的营养生长和生殖生长，缩短开花时间，从而影响植株的发育。因此可以将本专利技术的尸/^/co丄基因应用到促进植物生长发育和縮短开花时间中。本专利技术的尸/^/CO丄基因与植物表达载体连接，通过农杆菌介导进入植物细胞、组织或器官，通过组织培养成转基因的植物转化体，从而实现促进该植物的营养生长和生殖生长，縮短开花时间。所述的植物表达载体可为任意一种可用于根瘤农杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体等，如pBI系列载体、pBin系列载体、GatewayTW系列载体、pCAMBIA系列载体或其它衍生植物表达载体等，上述载体均为公开销售的商品。本专利技术所述的检测尸/^/09丄基因在蝴蝶兰植株组织中表达分布的方法，包括以下步骤(1) 制备蝴蝶兰的组织切片；(2) 将带有标记的特异性探针与蝴蝶兰的组织切片杂交结合；(3) 根据标记对原位杂交结果进行检测；所述的带有标记的特异性探针的序列为如SEQ ID N0.3所示序列的反义RNA链，该反义RNA链具体是指与SEQ ID NO.3所示序列互补的RNA链，该RNA链可以通过现有的很多方法获得，然后使其带上标记作为与蝴蝶兰的组织切片杂交的特异性探针。所述的标记可以为地高辛、生物素、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素，通过本领域技术人员公知的技术手段结合到探针上。本专利技术所述的制备蝴蝶兰的组织切片是按照常规的方法制备的，其具体步骤如下取蝴蝶兰的新鲜组织材料，立即置于4%多聚甲醛中固定12小时，再以乙醇梯度脱水，包埋于石蜡块中，将包埋好的材料修块后用切片机进行8nm连续切片，并将切片粘片于预涂过多聚赖氨酸的载玻片上，然后切片在42'C上展片，4(TC烘烤过夜。所述的杂交结合过程如下石蜡样品切片后脱蜡，复水并以蛋白酶消化组织蛋盐酸白，经预杂交后与事先变性处理的带有标记的特异性探本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蝴蝶兰光周期相关的ＰｈａｌＣＯＬ基因，其特征在于所述的ＰｈａｌＣＯＬ基因的核苷酸序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１中的第１５位至第１００１位碱基所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张建霞，段俊，曾宋君，吴坤林，
申请(专利权)人：中国科学院华南植物园，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]