新型细菌蛋白质纤维制造技术

本发明专利技术涉及用于作为生物纳米材料应用的芽孢杆菌内生孢子附属物(Ena)和新型蛋白质多聚体和纤维组装体的领域。具体地，本发明专利技术涉及由含有细菌DUF3992结构域的蛋白质亚基组成的自组装蛋白质，其含有保守的N

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新型细菌蛋白质纤维


[0001]本专利技术涉及用于作为生物纳米材料应用的芽孢杆菌内生孢子附属物(Ena)和新型蛋白质多聚体和纤维组装体的领域。具体地，本专利技术涉及由含有细菌DUF3992结构域的蛋白质亚基组成的自组装蛋白质，其含有保守的N
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末端含半胱氨酸区域，以及涉及工程化改造的蛋白质和它们的多聚体和纤维。此外，所述自组装蛋白质亚基的重组表达提供了新型蛋白质纳米纤维和修饰的展示表面(例如，芽孢杆菌孢子)的生产方法。最后，本文描述了所述多聚体、纤维和表面在生物医学和生物技术应用中的用途。

技术介绍

[0002]自组装分子为控制化学功能和形态以及生物活性提供了具有挑战性的机会。蛋白质的独特特性，包括其模块化性质、生物相容性和生物降解性，为设计智能纳米材料提供了令人兴奋的机会(Herrera Estrada&Champion，2015年；Jain等人，2018年)。受自然界的启发，一些蛋白质/肽被设计成自组装成各种复杂的结构，包括纳米颗粒、囊泡、网箱和纤维组装体；这些可以被赋予新的功能，在生物工程的不同领域提供大量应用(Matsuurua 2014；Katyal等人，2019)。改变自组装肽和蛋白质的氨基酸序列并操纵环境参数，可以调节特性并控制自组装以根据需要获得多样化的超分子纳米结构(Lombardi等人，2019)。氨基酸侧链的各种特性为它们的化学修饰提供了具有无限序列组合的可能性，以及修饰蛋白质的氨基和/或羧基末端可以将蛋白质聚合物的自组装调整为特定的纳米构造(Aluri等人，2012；Yu等人，1996)。因此，天然的自组装蛋白质或肽可以被工程化改造以诱导自组装以外的各种特性，包括自我修复、剪切稀化、形状记忆等(Chen和Zou，2019)。
[0003]当面临不利的生长条件时，属于厚壁菌门的细菌可以分化为代谢休眠和无生产性内生生孢子状态。由于其脱水状态和独特的多层细胞结构，这些内生孢子对环境压力源表现出极强的恢复力，甚至在其形成数百年后仍能萌发进入代谢活跃和复制的营养生长状态(Setlow,2014)。通过这种方式，属于厚壁菌门的芽孢杆菌和梭状芽孢杆菌能够承受长时间的干旱、饥饿、高氧或抗生素胁迫。内生孢子通常由包含细菌DNA的最内层脱水核心组成。核心被一层内膜包围，内膜被薄的肽聚糖层环绕，所述肽聚糖将作为孢子萌发过程中出现的营养细胞的细胞壁发挥功能。然后是厚的修饰肽聚糖的皮层，其对休眠至关重要(Atrih and Foster,1999)。皮层又被一些蛋白质包被层环绕。在一些梭状芽胞杆菌和大多数蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌群的菌种中，孢子被最外层松散配合的由(糖)蛋白和脂质组成的次晶外生孢子层包围(Stewart,2015)。芽孢杆菌和梭状芽胞杆菌内生孢子的表面也可以装饰有数微米长和几纳米宽的丝状附属物，所述附属物在菌株和菌种之间显示非常大的结构多样性(Hachisuka and Kuno,1976；Rode et al.,1971；Walker et al.,2007)。蜡样芽孢杆菌广义上是一组革兰氏阳性形成内生孢子的细菌，尽管它们具有系统发育关系，但仍显示出高度的生态多样性。由于其脱水状态和独特的多层细胞结构，其内生孢子对环境压力源表现出极强的恢复力，甚至在其形成数百年后仍能萌发进入代谢活跃和复制的营养生长状态(Setlow,2014)。蜡样芽孢杆菌内生孢子装饰有标识和功能未知的微米长附属
NO:1
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80、SEQ ID NO:145和SEQ ID NO:146的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1
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80、SEQ ID NO:145或SEQ ID NO：146中的任一序列具有至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％同一性的任何原核同源物，其中％同一性是在序列的全长窗口上计算的。事实上，本文描述的与本文公开的Ena1B折叠匹配的结构要求通常仍然代表具有与SEQ ID NO:8的结构参考序列具有甚至低于60％同一性的同源物的细菌蛋白质，因为细菌Ena家族被进一步分类在不同的成员中，如下所述。因此，一个实施方案涉及包含DUF3992结构域的分离的自组装蛋白，如通过与表1所示的其隐马尔可夫模型(Hidden Markov Model)比对所确定的，并且其中所述蛋白质亚基具有与Ena1B结构匹配的三维(预测)折叠，如本文所定义的折叠相似性分数为6.5或更高，并且其中Ena1B对应于SEQ ID NO:8，并且其中Ena1B参考结构对应于如本文在表2中提供的坐标，并且放置于PDB7A02。
[0006]在一个具体的实施方案中，本文所指的自组装蛋白质涉及所述Ena蛋白家族，如上文所定义，和/或由SEQ ID NO:1
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80、SEQ ID NO:145或SEQ ID NO:146中描述的氨基酸序列提供，其中分别提供了代表性示例：芽孢杆菌Ena1A(SEQ ID NO:1
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7)、Ena1B(SEQ ID NO:8
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14)、Ena1C(SEQ ID NO:15
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20)、芽孢杆菌Ena2A(SEQ ID NO:21
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28、SEQ ID NO:145)、Ena2B(SEQ ID NO：29
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37)、Ena2C(SEQ ID NO：38
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48、SEQ ID NO：146)，以及不同类型的其他芽孢杆菌Ena3(SEQ ID NO:49
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80)蛋白，或其任何一种的细菌直系同源物，所述同源物与SEQ ID NO:1
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80、SEQ ID NO:145或SEQ ID NO:146所示的任意序列具有至少80％的同一性。通过图16
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19中描绘的多序列比对，显示了Ena家族成员的序列保守区域和水平。
[0007]另一个实施方案涉及如本文所述的所述自组装蛋白质，其是工程化改造的自组装蛋白质，其中如本文所述的Ena折叠和HMM谱与如本文所述的Ena1B折叠和DUF3992谱相匹配，但其是“工程化改造的”或“修饰的”，进一步包括例如但不限于至少一种修饰，包括异源N
‑
或C
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末端标签、和/或空间阻断，蛋白质序列变体可以包含一个或多个与天然或野生型Ena序列相比的突变，或可以包含肽或支架的插入、或数个氨基酸的缺失、或可以作为Ena蛋白的分开部分提供，例如“分裂的”部分，在共同孵育时组装。
[0008]本专利技术的第二个方面涉及一种蛋白质多聚体，其包含或含有至少七个所述自组装蛋白质亚基，优选7个至最多十二个亚基，其是非共价连接的。更具体地，所述多聚体由七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个如本文定义的自组装Ena蛋白亚基组成，其通过β
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片层扩张非共价堆叠(Remaut和Waksman，2006中描述的蛋白质
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蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种分离的自组装蛋白质，其包含DUF3992结构域，其中所述蛋白质具有与Ena1B结构匹配的三维预测折叠，折叠相似性Z
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分数为6.5或更高，其中Ena1B对应于SEQ ID NO：8。2.根据权利要求1所述的自组装蛋白质，其中所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:1
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80、145或146、或与其中任一个具有至少80％同一性的同源物。3.一种工程化改造的自组装蛋白质，其包含权利要求1或2任一项所述的自组装蛋白质。4.一种多聚体，其包含根据权利要求1至3中任一项所述的至少七个蛋白质，其中所述蛋白质作为非共价连接的亚基存在于所述多聚体中。5.根据权利要求4所述的多聚体，其中至少一个亚基是根据权利要求3所述的工程化改造的自组装蛋白质。6.根据权利要求4或5所述的多聚体，其中所述亚基包含N
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末端区域并且包含C
‑
末端区域，所述N
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末端区域包含氨基酸序列基序ZX
n
CCX
m
C，其中Z是Leu、Ile、Val或Phe，n是1或2，m在10和12之间，所述C
‑
末端区域含有氨基酸序列基序GX
2/3
CX4Y，其中X是任何氨基酸。7.根据权利要求6所述的多聚体，其是工程化改造的多聚体，其特征在于至少一个工程化改造的自组装蛋白质亚基的N
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末端区域包含氨基酸序列基序ZX
n
CCX
m
C，其中m在13和16之间，或者其中m是7
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9。8.根据权利要求4或5所述的多聚体，其中所述亚基包含N
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末端区域并且包含C
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末端区域，所述N
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末端区域包含氨基酸序列基序ZX
n
C(C)X
m
C，其中Z为Leu、Ile、Val或Phe，n为1或2，m为10至12之间，(C)为任选的Cys，所述C
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末端区域含有氨基酸序列基序S
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Z
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N
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Y
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X
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B，其中Z是Leu或Ile，B是Phe或Tyr，X是任何氨基酸。9.重组产生的蛋白质纤维，其包含权利要求4至8中任一项所述的至少两个多聚体，其中所述多聚体纵向堆叠并通过至少一个二硫键共价连接。10.一种蛋白质纤维，其包含权利要求4至8中任一项所述的至少两个多聚体，其中所述多聚体纵向堆叠并通过至少一个二...

【专利技术属性】
技术研发人员：H，
申请(专利权)人：布鲁塞尔自由大学挪威生命科学大学，
类型：发明
国别省市：