抗菌肽突变体Sub168-QC/R、重组菌株及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种抗菌肽突变体Sub168

【技术实现步骤摘要】
抗菌肽突变体Sub168
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QC/R、重组菌株及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程及生物
，具体涉及抗菌肽突变体Sub168
‑
QC/R、重组菌株及其应用。

技术介绍

[0002]抗菌肽是一类具有广谱抗菌活性的小分子肽类物质，抗菌肽具有的多种抗菌机制使其具有不易产生耐药性的优点，在作为抗生素替代品的新型抗菌剂开发方面具有很大的优势及应用潜力。抗菌肽Sublancin168(Sub168)是枯草芽孢杆菌生长过程中的一种代谢产物，对革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌均有一定的抗菌活性。但该抗菌肽对致病菌的抗菌活性还不足以满足作为抗菌剂的应用，有待于通过分子生物学手段进行改造得到活性提升的突变体。且抗菌肽作为新型抗菌剂的开发，除了抗菌活性外，热稳定性、pH稳定性及消化酶稳定性也是影响其应用的关键性因素，在研究过程中上述关键特性的评价也极为必要。其中，由于动物胃肠道中含有多种消化酶，抗菌肽的消化酶稳定性是决定抗菌肽能否真正通过动物胃肠道从而实现对动物的生长起到促进作用的关键性因素。
[0003]抗菌肽Sublancin168已被证明能够抑制多种革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌的生长，但该抗菌肽想要作为抗菌剂在多领域中应用，还存在抗菌活性低等问题，此外，消化酶稳定性低也是影响该抗菌肽实际应用的重要因素。
[0004]为了降低生产成本，目前主要通过微生物宿主异源表达的方法对抗菌肽进行生产，以满足应用抗菌剂的高产量低成本需求。里氏木霉是一种近年来被广泛研究和应用的微生物表达宿主，具有表达量高、胞外分泌能力强等优点。且该宿主菌株被美国FAO认定为安全(GRAS)菌株，该菌株分泌生产的代谢产物被赋予的安全性特征也具有更广的应用范围。因此，利用里氏木霉对抗菌肽进行异源表达是生产抗菌肽的优势方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题在于通过对抗菌肽Sublancin168进行突变，筛选出抗菌效果好的突变体。
[0006]本专利技术是通过如下技术方案来实现的：
[0007]一种抗菌肽突变体Sub168
‑
QC/R，所述抗菌肽突变体Sub168
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QC/R的氨基酸序列是SEQ ID NO.1，所述抗菌肽突变体Sub168
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QC/R的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。
[0008]本专利技术的再一目的是提供包含上述抗菌肽突变体Sub168
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QC/R基因的木霉重组表达载体。
[0009]本专利技术的再一目的是提供包含上述抗菌肽突变体Sub168
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QC/R的重组菌株，所述菌株为里氏木霉Tu6。
[0010]本专利技术还提供一种抗菌剂，所述抗菌剂中包含所述的抗菌肽突变体Sub168
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QC/R。
[0011]本专利技术还提供所述抗菌肽突变体Sub168
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QC/R作为新型抗菌剂的应用。
[0012]本专利技术所述抗菌肽突变体Sub168
‑
QC/R的氨基酸序列是在原抗菌肽Sub168的基础
上，将34位点上的Q和36位点上的C同时突变为正电氨基酸R。
[0013]编码SEQ ID NO.1所述氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述SEQ ID NO.2是在原始氨基酸序列SEQ ID NO.3的抗菌肽Sub168基础上，翻译为编码的核苷酸序列SEQ ID NO.4，并进行该核苷酸片段的人工合成，对该人工合成的片段进行PCR反应获得的突变体核苷酸序列。
[0014]SEQ ID NO.1:
[0015]GLGKAQCAALWLQCASGGTIGCGGGAVACQNYRRFRR
[0016]SEQ ID NO.2:
[0017]GGATTGGGTAAGGCTCAATGTGCTGCTTTGTGGTTGCAATGTGCTTCAGGA
[0018]GGTACTATTGGATGTGGAGGTGGAGCTGTTGCTTGTCAAAACTACAGAAGA
[0019]TTTAGAAGA
[0020]SEQ ID NO.3:
[0021]GLGKAQCAALWLQCASGGTIGCGGGAVACQNYRQFCR
[0022]SEQ ID NO.4:
[0023]GGATTGGGTAAGGCTCAATGTGCTGCTTTGTGGTTGCAATGTGCTTCAGGA
[0024]GGTACTATTGGATGTGGAGGTGGAGCTGTTGCTTGTCAAAACTACAGACAA
[0025]TTTTGTAGA
[0026]本专利技术所述的一种抗菌肽突变体Sub168
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QC/R的制备方法，具体为：选择正电荷增加的策略，在原抗菌肽Sub168氨基酸序列的基础上，将34位点上的Q和36位点上的C同时突变为正电氨基酸R。抗菌肽Sub168的核苷酸序列，设计突变体制备所需的引物，使用PCR扩增的方式获得突变体的核苷酸序列，将PCR产物使用琼脂糖凝胶电泳验证，之后通过体外同源重组插入里氏木霉表达载体，构建抗菌肽Sub168突变体QC/R的里氏木霉表达载体Sub168
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QC/R
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pCBHG并对其进行测序验证。将构建的重组表达载体使用聚乙二醇介导的原生质体转化法转入到宿主里氏木霉Tu6中，经过转化子筛选及验证后，接入摇瓶进行发酵表达获得抗菌肽突变体Sub168
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QC/R。
[0027]本专利技术与现有技术相比的有益效果：
[0028]通过正电荷增加的策略及PCR扩增的方法得到了一种抗菌肽突变体Sub168
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QC/R的PCR片段，构建了该突变体的重组表达载体。
[0029]本专利技术将抗菌肽突变体Sub168
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QC/R在里氏木霉Tu6中异源表达，获得突变体的重组菌株及发酵表达产物，具备抗菌肽突变体Sub168
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QC/R在里氏木霉Tu6中的制备方法。
[0030]本专利技术表征了抗菌肽突变体Sub168
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QC/R的抗菌活性，其对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和产气角膜梭菌的活性较原抗菌肽Sub168有一定的提升。
[0031]本专利技术所述的抗菌肽突变体Sub168
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QC/R的胰蛋白酶稳定性较原抗菌肽Sub168有一定的提升。
[0032]本专利技术所述的抗菌肽突变体Sub168
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QC/R具有良好的热稳定性、pH稳定性和胃蛋白酶稳定性。
[0033]本专利技术所述抗菌Sub168肽突变体
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QC/R的特性有利于其作为新型抗菌剂的应用。
附图说明
[0034]图1为抗菌肽突变体Sub168
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QC/R热稳定性示意图；
[0035]图2为抗菌肽突变本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗菌肽突变体Sub168
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QC/R，其特征在于，所述抗菌肽突变体Sub168
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QC/R的氨基酸序列是SEQ ID NO.1，所述抗菌肽突变体Sub168
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QC/R的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。2.一种木霉重组表达载体，其特征在于，所述载体包含权利要求1所述抗菌肽突变体Sub168
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QC/R基因。3.一种重组菌株，其特征在于，所述重...

【专利技术属性】
技术研发人员：牟海津，梁青平，赵迎军，朱常亮，李东钰，张芳，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：