一种饲料中杆菌肽制剂的提取溶剂及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种饲料中杆菌肽制剂的提取溶剂。属于产品检测分析技术领域。本发明专利技术提取溶剂为12

【技术实现步骤摘要】
一种饲料中杆菌肽制剂的提取溶剂及检测方法


[0001]本专利技术涉及产品检测分析
，更具体的说是涉及一种饲料中杆菌肽制剂的提取溶剂及检测方法。

技术介绍

[0002]杆菌肽(bacitracin)，发现于1943年，是由芽孢杆菌分泌产生的多肽类抗生素，其抗菌谱与青霉素相似，主要用于治疗耐青霉素的葡萄球菌感染。杆菌肽不稳定，作为饲料药物添加剂使用时，需要与金属离子或双水杨酸络合形成稳定的络合物。目前杆菌肽的制剂主要为杆菌肽锌(bacitracin zinc)和亚甲基水杨酸杆菌肽(bacitracin methylene disalicylate)两种产品。杆菌肽锌，能有效地防治饲料中高剂量产气荚膜梭菌所造成的动物死亡和动物肝脏的病变。亚甲基水杨酸杆菌肽由于能在小肠的微酸性环境中溶解，比杆菌肽锌能更好地发挥其抗菌和促生长的作用，因此，杆菌肽锌和亚甲基水杨酸杆菌肽在国内外动物养殖和饲料生产中具有广泛应用。
[0003]但是，经有关学者进一步研究发现，使用杆菌肽制剂可能引起肾毒性，并可能有皮疹、瘙痒等不良反应。2019年7月9日农业农村部第194号公告的正式发布，标志着杆菌肽锌和亚甲基水杨酸杆菌肽制剂作为饲料添加剂退出饲料产品之列。为了更好地规范杆菌肽制剂作为饲料添加剂的使用，如何进行饲料中杆菌肽锌和亚甲基水杨酸杆菌肽的检测，成为目前人们关注的热点。
[0004]查阅国内外文献，仅存在针对饲料中单一杆菌肽锌的检测方法，未见亚甲基水杨酸杆菌肽的相关报道，且杆菌肽锌和亚甲基水杨酸杆菌肽理化性质存在较大差异。
[0005]因此，如何解决理化性质的较大差异，实现杆菌肽锌和亚甲基水杨酸杆菌肽的同时检测，是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术提供了一种饲料中杆菌肽制剂的提取溶剂及检测方法。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]一种饲料中杆菌肽制剂的提取溶剂，所述提取溶剂为氨水
‑
甲醇
‑
乙腈溶液，其中氨水的质量浓度为12
‑
15％，三者的体积比为1:1:1。
[0009]优选地，所述杆菌肽制剂为杆菌肽锌和亚甲基水杨酸杆菌肽中的一种或两种。
[0010]优选地，所述饲料为配合饲料、浓缩饲料和预混合饲料中的一种或几种。
[0011]上述操作的有益效果为：本专利技术提取溶剂可实现对配合饲料、浓缩饲料、预混合饲料中任意一种饲料中杆菌肽锌和亚甲基水杨酸杆菌肽的有效提取，提取率大于80％，为饲料中杆菌肽制剂的检测提供了技术支持。
[0012]本专利技术的另一目的是提供一种饲料中杆菌肽制剂的检测方法，包括如下步骤：
[0013](1)空白饲料样品提取：称取空白饲料样品，上述提取溶剂，进行提取离心，得上清液；
[0014](2)空白饲料样品净化：取步骤(1)中上清液，加入EDTA稀释，经C18固相萃取柱净化，经淋洗和洗脱后，收集洗脱液，氮气吹干加入已知浓度的杆菌肽A标准溶液复溶，混匀过滤，得空白饲料样品标准溶液；
[0015](3)饲料空白样品标准曲线：取空白饲料样品标准溶液进行液相色谱
‑
串联质谱测定，以杆菌肽定量离子色谱峰面积为纵坐标，对应的杆菌肽标准溶液质量浓度为横坐标，得空白饲料样品标准曲线；
[0016](4)取待测样品，按步骤(1)的方法提取，按步骤(2)的方法净化，氮气吹干加入甲醇水溶液复溶，混匀过滤，得待测样品溶液；
[0017](5)取步骤(4)所得待测样品溶液进行液相色谱
‑
串联质谱测定，得到待测样品溶液色谱峰面积，根据饲料空白样品标准曲线计算待测样品中杆菌肽A的含量。
[0018]上述操作的有益效果为：通过本专利技术特定的提取溶剂对待测样品进行提取，采用特定的C18固相萃取柱进行净化，实现了理化性质差异大的杆菌肽锌和亚甲基水杨酸杆菌肽的定性和定量检测，提高了本专利技术检测方法的正确度和精密度，提高了检测效率，简化了检测步骤，节约成本。
[0019]优选地，步骤(1)中提取样品与提取溶剂的质量体积比为0.2
‑
0.4g/mL。
[0020]优选地，步骤(1)中提取方式为涡旋震荡提取，涡旋时间0.5
‑
1min，振荡速度为900
‑
1000r/min，振荡提取时间15
‑
20min。
[0021]优选地，步骤(1)中离心步骤包括一次离心和二次离心，所述离心的离心转速为9000
‑
10000r/min，离心时间为3
‑
5min。
[0022]优选地，步骤(2)中上清液与EDTA溶液的质量体积比为0.25
‑
0.5ml；空白样品溶液过柱前，萃取柱依次用5ml甲醇、水预活化；淋洗液为质量浓度为15
‑
20％的乙腈水溶液，体积为3
‑
5ml；洗脱液为甲醇，体积为3
‑
5ml。
[0023]优选地，步骤(2)步骤(2)复溶时杆菌肽A标准溶液的加入量为1ml，浓度分别为0.01mg/L、0.02mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.5mg/L和1.0mg/L；复溶后涡旋30s混匀，经0.22μm微孔滤膜过滤。
[0024]优选地，步骤(4)中甲醇水溶液的质量浓度为20％，用量为1ml。
[0025]经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0026](1)本专利技术杆菌肽制剂提取溶剂，解决了杆菌肽锌和亚甲基水杨酸杆菌肽理化性质差异大，无法同时提取的问题；同时本专利技术杆菌肽提取溶剂也解决了不同饲料种类对提取效率的影响，使得本专利技术提取溶剂在不同饲料种类中对杆菌肽制剂的提取效率高达80％以上。
[0027](2)采用本专利技术提取溶剂对待测饲料进行定性和定量分析，并采用特定的C18固相萃取柱进行净化，提高了检测方法的正确度和精密度，为饲料中杆菌肽制剂的规范化使用提供了技术支持。
[0028](3)通过对杆菌肽锌和亚甲基水杨酸杆菌肽标准溶液在500
‑
2000范围内全扫描，形成的主要离子质荷比为712，为杆菌肽A(分子量1422.7)带2个电荷时的质荷比，未见杆菌肽锌(分子量1486)和亚甲基水杨酸杆菌肽(分子量1985)分子直接带电荷形成的离子。表明采用液相色谱串联质谱法分析饲料中杆菌肽锌和亚甲基水杨酸杆菌肽，分析对象确定为杆菌肽A，据此，选择杆菌肽A对空白饲料进行复溶，制备空白饲料样品标准溶液。
附图说明
[0029]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0030]图本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种饲料中杆菌肽制剂的提取溶剂，其特征在于，所述提取溶剂为氨水
‑
甲醇
‑
乙腈溶液，其中氨水的质量浓度为12
‑
15％，三者的体积比为1:1:1。2.根据权利要求1所述的一种饲料中杆菌肽制剂的提取溶剂，其特征在于，所述杆菌肽制剂为杆菌肽锌和亚甲基水杨酸杆菌肽中的一种或两种。3.根据权利要求1所述的一种饲料中杆菌肽制剂的提取溶剂，其特征在于，所述饲料为配合饲料、浓缩饲料和预混合饲料中的一种或几种。4.一种饲料中杆菌肽制剂的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)空白饲料样品提取：称取空白饲料样品，采用权利要求1
‑
3任一所述提取溶剂，进行提取离心，得上清液；(2)空白饲料样品净化：取步骤(1)中上清液，加入EDTA稀释，经C18固相萃取柱净化，经淋洗和洗脱后，收集洗脱液，氮气吹干加入已知浓度的杆菌肽A标准溶液复溶，混匀过滤，得空白饲料样品标准溶液；(3)饲料空白样品标准曲线：取空白饲料样品标准溶液进行液相色谱
‑
串联质谱测定，以杆菌肽定量离子色谱峰面积为纵坐标，对应的杆菌肽标准溶液质量浓度为横坐标，得空白饲料样品标准曲线；(4)取待测样品，按步骤(1)的方法提取，按步骤(2)的方法净化，氮气吹干加入甲醇水溶液复溶，混匀过滤，得待测样品溶液；(5)取步骤(4)所得待测样品溶液进行液相色谱
‑
串联质谱测定，得到待测样品溶液色谱峰面积，根据空白饲料样品标准曲线计算待测样品中杆菌肽A的含量。5.根据权利要求4所述的一种饲料中杆菌肽制剂的检测方法，其特征在于，步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴银良，徐峰，付岩，王全胜，张亮，
申请(专利权)人：宁波市农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：