提高卵母细胞体外成熟质量的添加剂及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种提高卵母细胞体外成熟质量的添加剂鹅肌肽(Anserine)，通过向卵母细胞体外培养液中添加鹅肌肽(Anserine)可以有效提高卵母细胞的体外成熟质量，进而提高卵母细胞的体外成熟率和后续胚胎的发育能力。通过技术的不断发展进步，不但可以提高人、牛、羊、小鼠等的卵母细胞质量，有效促进体外成熟和后续胚胎的发育，从而进行体外胚胎的生产应用；还为辅助生殖领域改进现有的卵母细胞体外成熟培养体系、促进其商业化的应用以及生物医学的发展奠定基础。的发展奠定基础。的发展奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
提高卵母细胞体外成熟质量的添加剂及应用


[0001]本专利技术涉及细胞培养
，特别涉及一种提高卵母细胞体外成熟质量的添加剂及应用。

技术介绍

[0002]卵母细胞体外成熟(in vivo maturation,IVM)技术旨在通过体外适宜培养条件将未成熟的卵母细胞培养成具有受精和胚胎发育能力的成熟卵母细胞，是克隆胚胎、体外受精胚胎、孤雌胚胎制备的重要环节。卵母细胞体外成熟培养在畜牧业上能够在体外大量生产出高质量的胚胎，降低生产成本，高效扩繁优良种畜，加速品种改良。在人类辅助生殖上可以充分利用未开发的生物资源，辅助治疗卵巢过度刺激综合征(OHSS)，提高生育率。此外，在科学研究中卵母细胞体外成熟培养能够用于卵母细胞老化和胚胎发育异常的机制、体细胞重编程机制的研究。
[0003]目前，虽然卵母细胞体外成熟培养技术已在畜牧领域、辅助生殖、生命科学领域得到广泛应用，但体外培养很难模拟体内卵泡的微环境，且体外培养过程中卵母细胞易受到氧化应激的影响，这导致体外培养的卵母细胞质量和体外成熟率不如体内卵母细胞。卵母细胞质量是决定体外成熟和后续胚胎发育能力的一个关键因素。此外，卵母细胞体外成熟培养过程中缺乏抗氧化酶和ROS清除剂，体外培养的卵母细胞抗氧化应激的能力比较弱，这影响着卵母细胞的质量。因此，深层次地探究卵母细胞成熟规律，改善卵母细胞体外成熟培养条件，提高卵母细胞体外成熟质量及后续胚胎发育效率具有重大意义。
[0004]Anserine(鹅肌肽，β
‑
丙氨酰
‑1‑
甲基L
‑
组氨酸)为高度稳定的水溶性二肽，通过促进尿酸排泄，缓解高尿酸血症的作用，天然存在于脊椎动物的骨骼肌组织和脑组织中，其具有约7.1的PK值，且在低PH值(<3.0)下保持完整。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种提高卵母细胞体外成熟质量的添加剂及应用，以提高卵母细胞体外培养的成熟质量。
[0006]根据本专利技术的第一个方面，提供了一种提高卵母细胞体外成熟质量的添加剂，该添加剂为鹅肌肽。由此，通过添加鹅肌肽在卵母细胞体外培养液中，可以提高卵母细胞体外成熟质量。
[0007]根据本专利技术的第二个方面，提供了鹅肌肽作为添加剂在制备具有提高卵母细胞体外成熟质量作用的产品中的应用。由此，含有鹅肌肽的该产品在卵母细胞体外成熟培养中可以提高卵母细胞体外成熟质量。
[0008]根据本专利技术的第三个方面，提供了一种卵母细胞体外成熟培养液，该培养液的组分包括：在TCM199培养基中添加0.6mM半胱氨酸、0.1IU/Ml人绒毛膜促性腺激素、0.1IU/mL马绒毛膜促性腺激素、10％胎牛血清、10％卵泡液及鹅肌肽。由此，该培养液可以提高卵母细胞在体外培养的成熟质量。
[0009]在某些实施方式中，鹅肌肽浓度为0.01
‑
10mM。
[0010]根据本专利技术的第四个方面，提供了一种卵母细胞体外成熟培养液在提高卵母细胞体外成熟质量上的应用。
[0011]根据本专利技术的第五个方面，提供了一种卵母细胞体外成熟培养液在提高卵母细胞线粒体膜电位水平上的应用。
[0012]根据本专利技术的第六个方面，提供了一种卵母细胞体外成熟培养液在降低猪卵母细胞中ROS水平上的应用。
[0013]根据本专利技术的第七个方面，提供了一种卵母细胞体外成熟培养液在孤雌胚胎培养中的应用。
[0014]根据本专利技术的第八个方面，提供了一种鹅肌肽在提高卵母细胞体外成熟质量上的应用。
[0015]根据本专利技术的第九个方面，提供了一种鹅肌肽在孤雌胚胎培养中的应用。
[0016]根据本专利技术的第十个方面，提供了一种鹅肌肽在提高卵母细胞线粒体膜电位水平上的应用。
[0017]根据本专利技术的第十一个方面，提供了一种鹅肌肽在降低猪卵母细胞中ROS水平上的应用。
[0018]本专利技术的有益效果：通过向卵母细胞体外培养液中添加鹅肌肽(Anserine)可以有效提高卵母细胞的体外成熟质量，进而提高卵母细胞的体外成熟率和后续胚胎的发育能力。通过技术的不断发展进步，不但可以提高人、牛、羊、小鼠等的卵母细胞质量，有效促进体外成熟和后续胚胎的发育，从而进行体外胚胎的生产应用；还为辅助生殖领域改进现有的卵母细胞体外成熟培养体系、促进其商业化的应用以及生物医学的发展奠定基础。
附图说明
[0019]图1为猪体内成熟卵泡(MFF)和未成熟卵泡液(IFF)中Anserine的相对水平结果图；
[0020]图2为对照组和Anserine处理组卵母细胞中线粒体膜电位水平结果图；
[0021]图3为对照组和Anserine处理组卵母细胞中ROS水平结果图。
具体实施方式
[0022]下面结合附图对专利技术作进一步详细的说明。
[0023]1、卵泡液非靶向代谢组学检测
[0024]为深入了解卵母细胞体外成熟过程，对体内成熟卵泡液和未成熟卵泡液进行了非靶向代谢组学检测分析。通过手术法采集发情母猪的卵巢获取体内成熟卵泡液，在体外采集未发情母猪卵巢中3～8mm的卵泡获取未成熟卵泡液，然后制备成上机样品后进行质谱检测。在代谢组学检测结果中，发现体内成熟卵泡液中Anserine(鹅肌肽，β
‑
丙氨酰
‑1‑
甲基L
‑
组氨酸)的相对水平显著高于未成熟卵泡液，约是未成熟卵泡液的2.5倍(如图1所示)。据此推测Anserine在卵母细胞成熟过程中发挥重要作用。
[0025]2、猪卵母细胞体外成熟培养液的配制方法
[0026]a、基础成熟培养液的配制方法(对照组)：TCM199培养基中添加0.6mM半胱氨酸、
0.1IU/Ml人绒毛膜促性腺激素、0.1IU/mL马绒毛膜促性腺激素、10％(V/V)胎牛血清、10％(V/V)屠宰场来源的猪卵泡液。
[0027]b、Anserine成熟培养液的配制方法(Anserine处理组)：在基础成熟培养液中添加0.01mM、0.1mM、1mM、5mM、10mM的Anserine(鹅肌肽)，配制成不同浓度的Anserine成熟培养液。
[0028]3、卵母细胞体外成熟培养
[0029]a、卵母细胞的收集
[0030]用25
‑
35℃的生理盐水(含青霉素、硫酸链霉素)浸泡采集的猪卵巢，并在3h内送回实验室。用预先加热至37℃的生理盐水清洗猪卵巢3
‑
5次，拿10mL注射器(带18号针头)从2
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6mm的卵泡中抽出卵泡液，自然沉淀15
‑
20min后去除上清，再用含双抗的DPBS重悬沉淀并放置3
‑
5min，再次去除上清，重复3次。在体视显微镜下挑选出至少有3层卵丘细胞包裹的高质量卵丘
‑
卵母细胞复合体(Cumulusoocytecomplexes,COCs)，并用含双抗的DPBS洗涤高质量的COCs本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.提高卵母细胞体外成熟质量的添加剂，其中，所述添加剂为鹅肌肽。2.权利要求1中所述的添加剂在制备具有提高卵母细胞体外成熟质量作用的产品中的应用。3.含有权利要求1中所述的添加剂的卵母细胞体外成熟培养液，其中，所述培养液的组分包括：在TCM199培养基中添加0.6mM半胱氨酸、0.1IU/Ml人绒毛膜促性腺激素、0.1IU/mL马绒毛膜促性腺激素、10％胎牛血清、10％卵泡液及鹅肌肽。4.根据权利要求3所述的培养液，其中，所述鹅肌肽浓度为0.0...

【专利技术属性】
技术研发人员：李紫聪，李亚楠，梁雅琳，张宇星，招华兴，张贤君，吴珍芳，蔡更元，洪林君，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
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