体外哺乳动物卵母细胞－卵冠丘细胞复合物重组液制造技术

本发明专利技术属于生殖医学工程技术领域。具体涉及一种体外哺乳动物卵母细胞－卵冠丘细胞复合物重组液，本发明专利技术以低糖TCM199培养液联合血清或血清替代物补充为基础，通过添加激素、能量物质、抗氧化剂烟酰胺、促进细胞紧密连接的低分子量透明质酸等提供了一种可人工组装卵丘细胞

【技术实现步骤摘要】
体外哺乳动物卵母细胞－卵冠丘细胞复合物重组液


本专利技术属于生殖医学工程
，具体涉及体外哺乳动物卵母细胞－卵冠丘细胞复合物重组液。

技术介绍

现有技术公开了哺乳动物卵子在其成熟排放前，周围包裹着一群特殊的体细胞——卵冠丘颗粒细胞，简称卵丘细胞。卵丘细胞包裹的卵母细胞称为卵丘细胞－卵母细胞复合物(Cumulus
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oocyte complex,COC)。卵丘细胞通过跨透明带的纳米管道结构(transzonal projections，TZPs)与卵母细胞建立联系，为卵母细胞的发育及成熟提供各种蛋白、RNA以及线粒体等细胞器。因此，相比完整的COC，脱去卵丘细胞的卵母细胞(裸卵)发育成个体的潜能显著降低。
[0003]众多研究发现，哺乳动物包括人类卵子在体外成熟过程中，往往存在核成熟而胞浆不成熟的情况。本专利技术研究团队研究发现成熟卵子中的10万个线粒体(基因组)来自卵丘细胞的输送。裸卵失去了卵丘细胞的包裹而导致其在成熟过程中线粒体拷贝数不再增加，致使其胞浆不成熟。另据报道，随着职场女性生育年龄的延迟以及我国二胎三胎政策的放开，在辅助生殖领域出现越来越多的大龄或中年助孕女性。该类女性的助孕成功率明显低于育龄期女性的成功率，其中一个重要的因素是其获得的COC中的卵丘细胞连接松散、缺失甚至呈裸卵状态，严重影响其受精及后续发育潜能。在生殖临床穿刺取卵中发现大量的颗粒细胞包括卵丘细胞散落在穿刺取卵液中，如果能建立一种将卵丘细胞与卵母细胞重组成COC的体外体系，将具有重大的理论意义和巨大的应用价值：一方面可以改善裸卵或中年卵子的胞浆成熟度，提高妊娠率；另一方面可以将重组COC体系用于研究，进一步深入研究卵丘细胞与卵子之间的交流，为临床进一步改善卵子质量提高妊娠结局奠定基础。现有技术公开了卵子中拥有十万个线粒体拷贝数，但迄今为止尚未见有关所述线粒体均来自卵丘细胞的提供以及卵丘细胞与卵子既然可以拆分，也可以再组装等的报道。因此，卵丘细胞对卵子发育成熟的重要性急需提高到一个新的高度。面对不同阶段的裸卵，往往采用在成熟液中添加各种营养因子或激素来提高卵子的成熟度，但线粒体这类对胚胎发育极其重要的细胞器不能通过添加于培养液而进入卵子胞浆。基于现有技术的现状，本申请的专利技术人拟提供体外哺乳动物卵母细胞－卵冠丘细胞复合物重组液，以进一步用于将裸卵与卵丘细胞重组成COC复合物，使卵子胞浆充分成熟。

技术实现思路

本专利技术的目的在于基于现有技术的现状，提供体外哺乳动物卵母细胞－卵冠丘细胞复合物重组液，尤其是一种专业高效的哺乳动物卵丘细胞与卵母细胞重组成COC的体外重组液，用于将裸卵与卵丘细胞重组成COC复合物，使卵子胞浆充分成熟。
本专利技术的哺乳动物卵丘细胞与卵母细胞重组成COC的体外重组液，包含80％体积的基础培养液TCM199、20％体积的血清或血清替代物补充剂(Serum Substitute Supplement,SSS)。TCM199与血清/SSS的总体积为100％；其中还含有低分子量透明质酸(Hyaluronic acid)、烟酰胺(Nicotinamide mononucleotide，NMN)，丙酮酸钠、FSH、HCG、雌激素、NGF、BDNF等。本专利技术液不含抗生素。上述所述哺乳动物COC重组液，其组份为：以TCM199与血清/SSS总体积为基准，其中还含有0.0020g/ml丙酮酸钠，0.1IU/ml的FSH,0.5IU/ml HCG，1.0μg/ml雌激素，10μM烟酰胺，200～400μg/ml低分子量透明质酸，10ng/ml NGF，10ng/ml BDNF。本专利技术以低糖TCM199培养液联合血清替代物补充为基础，通过添加激素、能量物质、抗氧化剂烟酰胺、促进细胞紧密连接的透明质酸等研发了本专利技术。本专利技术中，丙酮酸钠为COC成熟提供能量；FSH,HCG和雌激素促进COC成熟；烟酰胺作为抗氧化剂清除重组液中产生的氧活性物质(ROS)，低分子量透明质酸促进卵丘细胞与卵母细胞建立连接以及卵丘细胞之间的紧密化，NGF与BDNF是神经生长因子，作用于卵丘细胞，通过调节FSHr受体的表达，调节重构COCs自分泌与旁分泌信号通路。本专利技术提供了一种可提高卵母细胞成熟度及后续发育潜能的COC重组液。应用本专利技术的重组液，可使裸卵重新获得卵丘细胞的包裹与支持，也可使老龄卵子获得更多紧密包裹的卵丘细胞，为卵子的胞浆成熟输送足够的线粒体。经本课题组对本专利技术在小鼠上的应用发现，重组COCs的卵子中线粒体拷贝数显著高于裸卵；在人上的应用发现，重组COC的卵子第一极体排放率、受精率及优质胚胎率显著高于未重组的裸卵。本专利技术还添加了透明质酸(Hyaluronic acid)；透明质酸可提高细胞粘附力，使细胞之间连接紧密；本专利技术还应用了烟酰胺(Nicotinamide mononucleotide，NMN)清除COC体外重组及培养过程中产生的ROS，同时其还可高效地促进卵母细胞核及胞浆成熟。本专利技术还应用了血清替代物补充(SSS)，避免了使用其他血清对卵子发育成熟引起的副作用。本专利技术应用于小鼠重组COC试验中，来自重组COC的卵子线粒体拷贝数显著高于未重组裸卵(p<0.01)。本专利技术经试验表明：(1)卵子中的线粒体来自周围卵冠丘颗粒细胞的输送，而非重头合成；(2)失去卵丘颗粒细胞的裸卵可以经重组液重新获得卵球细胞的包裹与支持；(3)高龄或老化卵子可通过重组获得颗粒细胞的包裹与支持，改善其发育潜能；(4)裸卵在体外成熟培养后，其胞浆成熟度不够的原因是线粒体拷贝数不足导致。本专利技术产生了以下有益的应用价值：(1)本专利技术适合用于IVF
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ET周期中高龄女性COCs的成熟优化及未成熟卵母细胞的COCs重组后再利用，提高IVF临床成功率。(2)本专利技术适合用于科研探索卵丘细胞(颗粒细胞)与卵母细胞之间的交流，揭示卵母细胞发育成熟的调控机制。(3)本专利技术适合广泛用于动物胚胎工程，提高经济动物胚胎移植成功率，产生经济价值。
具体实施方式
下述实施是对本专利技术的进一步说明，以作为对本专利技术
技术实现思路
的阐释。但本专利技术的实质内容不仅限于以下实施所述。本领域的从业技术人员可以且应当知晓任何基于本发
明的简单改变或替换均应属于本专利技术所要求的保护范围。实施例1：使用卵母细胞－卵冠丘细胞复合物(COC)重组液重构人COC促进卵子成熟实施如下：本专利技术的卵子COC重组液组成如下：80％TCM199+20％体积的自体血清+0.0020g/ml丙酮酸钠+0.1IU/ml的FSH,0.5IU/ml HCG+1.0μg/ml雌激素+10μM烟酰胺+200～400μg/ml低分子量透明质酸+10ng/ml NGF+10ng/ml BDNF。其中：a.基础培养基：TCM199，500毫升装，低糖，不含HEPEAS，GIBCO，批号：b.丙酮酸钠：a
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ketopropionic acid，Sigma,P
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2256；c.雌激素：17β
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Estradiol,Sigma,E
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2758；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.体外哺乳动物卵母细胞－卵冠丘细胞复合物重组液，其特征在于：以80％TCM199+20％体积的自体血清或血清替代品(SSS)为基础，其组成成分为：0.0020g/ml丙酮酸钠+0.1IU/ml的FSH,0.5IU/ml HCG+1.0μg/ml雌激素+10μM烟酰胺+200～400μg/ml低分子量透明质酸+10ng/ml NGF+10ng/ml BDNF。2.按权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：沙红英，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：