本发明专利技术提供：人原始生殖细胞(hPGC)或来自人多能干细胞的人原始生殖细胞样细胞(hPGCLC)的维持扩增方法，该方法包括：在(i)佛司可林或磷酸二酯酶4(PDE4)抑制剂、以及(ii)选自碱性成纤维细胞增殖因子(bFGF)、白血病抑制因子(LIF)和上皮生长因子(EGF)的1种以上的细胞因子的存在下培养hPGCLC。细胞因子的存在下培养hPGCLC。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】人原始生殖细胞/人原始生殖细胞样细胞的维持扩增方法
[0001]本申请根据2020年8月18日在美国申请的临时申请第63/066,914号和2020年8月19日在美国申请的临时申请第63/067,776号要求优先权，将其内容引用于此。
[0002]本专利技术涉及人原始生殖细胞/人原始生殖细胞样细胞的维持扩增方法、以及用于该方法的试剂等。
技术介绍
[0003]生殖细胞系统不仅保证遗传信息的连续性和多样性，还保证超过一代的表观遗传信息的连续性和多样性，从而成为规定物种的持久性和进化的基础。在人的情况下，生殖细胞发育的异常会导致病理状态，包括不育症和子代的遗传或表观遗传疾病，因此生殖细胞的产生机理的研究是成为生物学和医学两者的基础的主题。
[0004]使用小鼠作为模型动物，进行哺乳动物的生殖细胞的产生机理的研究，报道了小鼠中的生殖细胞的产生在体外的重构。作为其一例，本专利技术人以前报道了以下的方法：使用刺激cAMP在细胞内产生的佛司可林和咯利普兰，使小鼠的原始生殖细胞(PGC)/原始生殖细胞样细胞(PGCLC)在体外增殖(专利文献1、非专利文献1)(以下，有时将小鼠的PGC称为“mPGC”、将小鼠的PGCLC称为“mPGCLC”)。
[0005]另一方面，人生殖细胞的产生机理的研究因难以分析人生殖细胞的产生和缺乏适当的实验系统，迄今为止未充分进行。在这样的状况下，Gell等人报道了：在包含佛司可林和咯利普兰的培养系统中，在体外培养人的原始生殖细胞样细胞(以下，有时将人的PGCLC称为“hPGCLC”)(非专利文献2)。然而，Gell等人的报道中的hPGCLC的增殖在10天内为2倍左右，在实际使用上谈不上充分。
[0006]现有技术文献
[0007]专利文献
[0008]专利文献1：国际公开2019/107576号；
[0009]非专利文献
[0010]非专利文献1：Ohta等人，The EMBO Journal，(2017)第36卷，第1888
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1907页；
[0011]非专利文献2：Gell等人，Stem Cell Reports，(2020)第14卷，第433
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446页。
技术实现思路
[0012]专利技术所要解决的课题
[0013]因此，本专利技术的课题是：提供使人的原始生殖细胞(以下，有时将人的PGC称为“hPGC”)/hPGCLC更有效地增殖的方法。
[0014]用于解决课题的手段
[0015]本专利技术人发现：通过在佛司可林和细胞因子的存在下培养所分离的hPGCLC，可维持扩增hPGCLC。根据本专利技术的方法，可长期(例如120天以上)培养hPGCLC。由基因表达状态的分析确认到：通过本专利技术的方法培养的hPGCLC在保持初期的人PGC的性质的同时增殖。另
外，由基因组DNA甲基化状态的分析判明：hPGCLC大致维持培养期间的DNA甲基化状态。
[0016]这与mPGCLC的培养系统(专利文献1、非专利文献1)形成对照，在该培养系统中观察到增殖所伴随的全基因组(genome
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wide)的DNA的去甲基化，暗示了在人中以不同于小鼠的机理进行表观基因组信息重组的可能性。
[0017]为了进一步验证已增殖的hPGCLC的功能，本专利技术人模仿卵巢内环境进行了重构卵巢培养。其结果确认到：来自hPGCLC的细胞表达DDX4(还作为VASA同系物而已知)或DAZL等基因，在形态上也分化成具有卵原细胞的特征的卵原细胞样细胞。即，确认到在该培养系统中维持了作为生殖细胞的性质。
[0018]另外，本专利技术人在hPGCLC的维持扩增培养中通过使用了hPGC标志物、死细胞标志物、人特异性细胞表面抗原的FACS分析测定扩增hPGCLC和去分化的细胞的细胞数，算出扩增PGCLC细胞数与去分化细胞数之比的对数转换值(enrichment score：富集分数)，从而确立了评价该培养系统中的hPGCLC的维持扩增效率的方法。另外，还发现了：通过适当选择饲养细胞，即使不分选来自hPGCLC的细胞和饲养细胞，也可通过分选hPGC标志物阳性细胞和其以外的细胞，对非hPGC标志物阳性细胞进行FACS分析并附于FSC/SSC双向图，来识别由hPGCLC去分化的细胞和饲养细胞。
[0019]而且，本专利技术人利用该评价法，在上述的hPGCLC的维持扩增培养系统中添加各种信号传导途径(传导路径)的抑制剂以评价hPGCLC的维持扩增效率(由hPGCLC的去分化率)时，发现了Wnt信号传导抑制剂、特别是促进β
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连环蛋白的分解和/或抑制核内转移的物质显著地抑制hPGCLC的去分化。
[0020]本专利技术人根据这些见解进一步反复研究，结果完成了本专利技术。
[0021]即，本专利技术如下。
[0022][1]人原始生殖细胞(hPGC)或来自人多能干细胞的人原始生殖细胞样细胞(hPGCLC)的维持扩增方法，该方法包括：在(i)佛司可林或磷酸二酯酶4(PDE4)抑制剂、以及(ii)选自碱性成纤维细胞增殖因子(bFGF，碱性成纤维细胞生长因子)、白血病抑制因子(LIF)和上皮生长因子(EGF)的1种以上的细胞因子的存在下培养hPGC或hPGCLC。
[0023][2][1]所述的方法，其中，上述(i)的药剂为佛司可林。
[0024][3][1]或[2]所述的方法，其中，上述细胞因子为LIF和EGF的组合、单独的bFGF、或者LIF、EGF和bFGF的组合。
[0025][4][1]～[3]中任一项所述的方法，其中，hPGCLC是经由人初期中胚层样细胞(hiMeLC)诱导的细胞。
[0026][5][4]所述的方法，其中，hPGCLC是通过在成骨蛋白4(BMP4)、以及任意地选自干细胞因子(SCF)、LIF和EGF的1种以上的细胞因子的存在下培养hiMeLC 5～8天而诱导的。
[0027][6][1]～[5]中任一项所述的方法，该方法包括：在上述培养中，以hPGC标志物阳性为指标分选hPGC或hPGCLC，进行传代培养。
[0028][7][6]所述的方法，其中，hPGC标志物为BLIMP1和/或TFAP2C、或者INTEGRINα6和EpCAM。
[0029][8][6]或[7]所述的方法，其中，培养hPGC或hPGCLC至少30天。
[0030][9][1]～[8]中任一项所述的方法，该方法包括：在上述培养中，在进一步包含(iii)Wnt信号传导抑制剂的条件下培养hPGC或hPGCLC。
[0031][10][9]所述的方法，其中，Wnt信号传导抑制剂为促进β
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连环蛋白的分解和/或抑制核内转移的物质。
[0032][10a][9]所述的方法，其中，Wnt信号传导抑制剂为IWR1或XAV939。
[0033][11]制造包含hPGC或hPGCLC的细胞群的方法，其包括：利用[1]～本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.人原始生殖细胞(hPGC)或来自人多能干细胞的人原始生殖细胞样细胞(hPGCLC)的维持扩增方法，该方法包括：在(i)佛司可林或磷酸二酯酶4(PDE4)抑制剂、以及(ii)选自碱性成纤维细胞增殖因子(bFGF)、白血病抑制因子(LIF)和上皮生长因子(EGF)的1种以上的细胞因子的存在下培养hPGC或hPGCLC。2.权利要求1所述的方法，其中，上述(i)的药剂为佛司可林。3.权利要求1或2所述的方法，其中，上述细胞因子为LIF和EGF的组合、单独的bFGF、或者LIF、EGF和bFGF的组合。4.权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，hPGCLC是经由人初期中胚层样细胞(hiMeLC)诱导的细胞。5.权利要求4所述的方法，其中，hPGCLC是通过在成骨蛋白4(BMP4)、以及任意地选自干细胞因子(SCF)、LIF和EGF的1种以上的细胞因子的存在下培养hiMeLC 5～8天而诱导的。6.权利要求1～5中任一项所述的方法，该方法包括：在上述培养中，以hPGC标志物阳性为指标分选hPGC或hPGCLC，进行传代培养。7.权利要求6所述的方法，其中，hPGC标志物为BLIMP1和/或TFAP2C、或者INTEGRINα6和EpCAM。8.权利要求6或7所述的方法，其中，培养hPGC或hPGCLC至少30天。9.权利要求1～8中任一项所述的方法，该方法包括：在上述培养中，在进一步包含(iii)Wnt信号传导抑制剂的条件下培养hPGC或hPGCLC。10.权利要求9所述的方法，其中，Wnt信号传导抑制剂是促进β
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连环蛋白的分解和/或抑制核内转移的物质。11.制造包含hPGC或hPGCLC的细胞群的方法，该方法包括：利用权利要求1～10中任一项所述的方法维持扩增hPGC和/或hPGCLC的工序。12...
【专利技术属性】
技术研发人员：斋藤通纪，村濑佑介，
申请(专利权)人：国立大学法人京都大学，
类型：发明
国别省市：
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