EGCG联合CHK2抑制剂在改善卵成熟或胚胎发育中的应用制造技术

本发明专利技术公开了EGCG联合CHK2抑制剂在制备改善卵成熟或胚胎发育的制剂中的应用，属于哺乳动物的辅助生育技术领域。本发明专利技术还公开了一种改善卵成熟或胚胎发育的制剂，有效成分为EGCG和CHK2抑制剂。本发明专利技术还公开了CHK2抑制剂在制备改善卵成熟或胚胎发育的制剂中的应用。本发明专利技术通过研究发现，低浓度的CHK2抑制剂BML

【技术实现步骤摘要】
during the first cleavage of mouse embryos”)，应用25μM的BML
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277可严重影响早期胚胎的发育，使得胚胎DNA损伤而引发氧化应激。
[0008]最近有研究报导(“Dominant mutations in CHK1 cause pronuclear fusion failure and zygote arrest that can be rescued by CHK1 inhibitor”)，编码细胞周期检查点激酶1(Checkpoint kinase 1，CHK1)的基因突变可导致人类受精卵分裂障碍，突变使得CHK1的激酶活性升高，通过磷酸化并抑制下游CDC25C/CDK1通路引起受精卵的细胞周期阻滞；根据该机理，应用合适浓度的CHK1抑制剂使突变CHK1的激酶活性维持在正常阈值可成功使患者受精卵发育成可移植囊胚。CHK1是细胞周期检查点通路中发挥重要作用的蛋白激酶，与DNA损伤反应通路共同组成基因组的监控系统。尽管应用CHK1抑制剂处理的囊胚基因组倍性完整并具有多能性，抑制CHK1治疗卵裂障碍的远期安全性目前无法得知，需要探索更安全有效的胚胎培育方案。

技术实现思路

[0009]针对上述现有技术，本专利技术通过研究，发现EGCG、CHK2抑制剂以及它们的联合在改善卵成熟、胚胎发育方面具有较大的应用潜能。
[0010]本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0011]EGCG联合CHK2抑制剂在制备改善卵成熟或胚胎发育的制剂中的应用。
[0012]所述卵成熟具体是指哺乳动物的卵母细胞尤其是老年卵(临床上一般指年龄大于37岁的患者卵，实验中常用9月龄以上的小鼠卵作为老年卵模型)的成熟率。
[0013]所述改善卵成熟具体体现为以下功效之一或若干或全部：提高卵母细胞尤其是老年卵的成熟率，降低卵母细胞死亡与碎片化的比例，降低卵母细胞内的活性氧，改善卵母细胞内的线粒体分布，提升卵母细胞内的线粒体膜电位，改善卵母细胞内的纺锤体形态，降低卵母细胞内异常纺锤体的比例，提高卵母细胞内的ATP含量。
[0014]所述胚胎发育具体是指哺乳动物的受精卵发育到囊胚的能力。
[0015]所述改善胚胎发育具体体现为：提高受精卵发育至囊胚阶段的成功率。
[0016]进一步地，所述CHK2抑制剂选自BML
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277。
[0017]一种改善卵成熟或胚胎发育的制剂，有效成分为EGCG和CHK2，其中，EGCG的有效浓度为1～100μM，CHK2抑制剂的有效浓度为0.01～100nM。优选的，EGCG的有效浓度为5～20μM，更优选10μM；CHK2抑制剂的有效浓度为5～20nM，更优选10nM。
[0018]进一步地，所述改善卵成熟或胚胎发育的制剂中还含有基础的胚胎培养基所述基础的胚胎培养基，选自本领域已知的任何合适的哺乳动物胚胎培养基，例如碳酸氢盐缓冲培养基，Hepes缓冲或MOPS缓冲培养基或磷酸缓冲盐水，G1/G1
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Plus，G2/G2
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Plus，GMOPS，KSOM，M16，M2，PBS等常用培养基。
[0019]CHK2抑制剂在制备改善卵成熟或胚胎发育的制剂中的应用。
[0020]进一步地，所述CHK2抑制剂选自BML
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277。
[0021]EGCG在制备改善卵成熟或胚胎发育的制剂中的应用。
[0022]本专利技术通过研究发现，低浓度的CHK2抑制剂BML
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277可明显提高小鼠老年卵母细胞的发育率，且与适当浓度的EGCG联合应用可取得更优的发育结局。这与此前报道的高浓度的(25μM)的BML
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277严重影响早期胚胎发育的结果相反，这可能是由于低浓度的BML
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277
可通过代偿机制，引起其它DNA损伤修复通路激活从而促进高龄卵发育。这表明，CHK2抑制剂BML
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277，以及EGCG联合CHK2抑制剂，在改善哺乳动物特别是老年哺乳动物的受精能力与妊娠结局方面具有较大的应用潜能。本专利技术对赋予生殖技术的研究、发展具有重要意义和价值。
[0023]本专利技术使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
附图说明
[0024]图1：小鼠突变(p.F441fs*16)受精卵用不同浓度的含EGCG的培养基处理后的卵裂情况典型图片。
[0025]图2：小鼠突变(p.F441fs*16)受精卵用不同浓度的含EGCG的培养基处理后的卵裂情况统计图。
[0026]图3：小鼠突变(p.F441fs*16)受精卵用不同浓度的含EGCG的培养基处理后的囊胚发育情况典型图片。
[0027]图4：小鼠突变(p.F441fs*16)受精卵用不同浓度的含EGCG的培养基处理后的囊胚发育情况统计图。
[0028]图5：小鼠野生(WT)和突变(p.F441fs*16)受精卵用含EGCG的培养基(10μM)处理后所获得囊胚的内细胞团(OCT3/4)与滋养层因子(Cdx2)表达情况
[0029]图6：小鼠野生(WT)和突变(p.F441fs*16)受精卵用含EGCG的培养基(10μM)处理后所获得囊胚的内细胞团因子(OCT3/4)表达情况统计图。
[0030]图7：小鼠野生(WT)和突变(p.F441fs*16)受精卵用含EGCG的培养基(10μM)处理后所获得囊胚的滋养层因子(Cdx2)表达情况统计图。
[0031]图8：年轻小鼠卵母细胞用含EGCG的培养基(10μM)处理后所获成熟卵(MⅡ)的典型图。
[0032]图9：年轻小鼠卵母细胞用含EGCG的培养基(10μM)处理后所获成熟卵(MⅡ)的统计图。
[0033]图10：年轻小鼠卵母细胞用含EGCG的培养基(10μM)处理后所获MⅡ卵的ROS表达图。
[0034]图11：年轻小鼠卵母细胞用含EGCG的培养基(10μM)处理后所获MⅡ卵的ROS荧光信号统计图。
[0035]图12：老年小鼠卵母细胞用含EGCG的培养基(10μM)处理后所获成熟卵(MⅡ)的典型图。
[0036]图13：老年小鼠卵母细胞用含EGCG的培养基(10μM)处理后所获成熟卵(MⅡ)的统计图。
[0037]图14：老年小鼠卵母细胞用含EGCG的培养基(10μM)处理后所获MⅡ卵的ROS表达图。
[0038]图15：老年小鼠卵母细胞用含EGCG的培养基(10μM)处理后所获MⅡ卵的线粒体分布图。
[0039]图16：老年小鼠卵母细胞用含EGCG的培养基(10μM)处理后所获MⅡ卵的线粒体电位检测图。
[0040]图17：老年小鼠卵母细胞用含EGCG的培养基(10μM)处理后所获MⅡ卵的纺锤体形态图。
[0041]图18：老年小鼠卵母细胞用含EGCG的培养基(10μM)处理后所获MⅡ卵的ROS荧光信号统计图。
[0042]图1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.EGCG联合CHK2抑制剂在制备改善卵成熟或胚胎发育的制剂中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述改善卵成熟的制剂具有以下之一或若干或全部的功效：提高卵母细胞的成熟率，降低卵母细胞死亡与碎片化的比例，降低卵母细胞内的活性氧，改善卵母细胞内的线粒体分布，提升卵母细胞内的线粒体膜电位，改善卵母细胞内的纺锤体形态，降低卵母细胞内异常纺锤体的比例，提高卵母细胞内的ATP含量；所述改善胚胎发育的制剂具有以下功效：提高受精卵发育至囊胚阶段的成功率。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述卵母细胞选自老年卵。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述CHK2抑制剂选自BML
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277。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈子江，赵涵，张鸿惠，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：