一种人造皮肤及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于护肤品技术领域，具体涉及一种人造皮肤的制备和应用。本申请通过构建一种包括琼脂糖和PEG

【技术实现步骤摘要】
一种人造皮肤及其制备方法和应用

：
[0001]本专利技术属于护肤品
，具体涉及一种人造皮肤的制备和应用。

技术介绍
：
[0002]随着当今社会对美的不断追求，护肤品已经进入千家万户，人们更加重视自己的肌肤情况。但是护肤品市场良莠不齐，敏感肌人群如何有效选择刺激性小又有效的护肤品是目前护肤品研究上的棘手问题。护肤品市场缺少一种直接作用于人体的、直观的测试模型和评价方法。
[0003]人体皮肤的主要组成细胞——人上皮细胞(HaCaT)可接受各种外界刺激，激活胞内复杂的信号传递机制。本申请通过构建一种包括琼脂糖和PEG
‑
2000的培养皿底作为培养人皮肤类器官的骨架，将人上皮细胞和人间质细胞共培养，并找到合适的细胞浓度和生长因子，使其自发形成片状、非粘附性的、具有结构的组织，用其模拟人类皮肤，跳脱出传统的动物模型，采用人造人皮肤类器官，更加直观的展现护肤品的刺激性和护肤品功能的有效性。

技术实现思路
：
[0004]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种人造皮肤及其制备方法和应用，所述人造皮肤可测试护肤品刺激性，也可体现护肤品的有效性。
[0005]本专利技术提供的技术方案之一，是一种人造皮肤的制备方法，包括如下步骤：
[0006]S1：将浓度为1％
‑
1.5％(w/v)的琼脂溶液，高温高压灭菌后趁热与已经融化的PEG
‑
2000混合，均匀的倒在培养皿中，铺满皿底，置于超净台中冷却至室温，获得琼脂
‑
PEG2000培养皿；
[0007]进一步地，培养皿底面积为5cm2；
[0008]进一步地，琼脂溶液与PEG
‑
2000的体积比为5:1
‑
8:1；
[0009]进一步地，PEG
‑
2000固体的融化温度为30
‑
55℃；
[0010]S2：取HaCaT细胞与HSF细胞按细胞数量5:1
‑
10:1混合，轻轻吹打混匀，将细胞混合液置于琼脂
‑
PEG2000培养皿中；
[0011]进一步地，所述HaCaT细胞与HSF细胞为状态良好的4代以内细胞；
[0012]进一步地，HaCaT细胞与HSF细胞按8:1混合；
[0013]进一步地，底面积为5cm2的培养皿中细胞总量达到106ꢀ‑
107个；
[0014]S3：每106ꢀ‑
107个混合细胞中，加入5ml含有生长因子Y27632和表皮生长因子EGF的DMEM培养基(含有5％ FBS)37℃，5％ CO2培养箱培养；
[0015]进一步地，培养基中Y27632的浓度为10mM，表皮生长因子EGF浓度为0.1mg/ml；
[0016]S4：72h
‑
96h后细胞混合物有明显的自组织现象后，更换培养基为DMEM(含有5％ FBS)继续培养；
[0017]S5：换液培养72h
‑
96h后，观察到成片生长的皮肤，即人造皮肤建成，可用于后续药
物试验。
[0018]本专利技术提供的技术方案之二，是由上述方法制备的人造皮肤。
[0019]本专利技术提供的技术方案之三，是上述人造皮肤的应用，特别是在护肤品/化妆品筛选和评价及测试中的应用，所述人造皮肤即人皮肤类器官可用于检测化妆品的刺激性，同时可以检测护肤品/化妆品的有效性。
[0020]进一步地，所述护肤品/化妆品包括但不限于洗面奶、卸妆水、清洁霜、花露水、爽身粉、沐浴液、洗发液、护肤霜、乳液、精华、化妆水、面膜、唇膏、唇油、护发素、粉饼、胭脂、眼影、眼线笔、眉笔、香水、粉底、隔离霜或粉饼等。
[0021]有益效果：
[0022]本专利技术提供的人造皮肤的制备方法，通过制备琼脂糖和PEG
‑
2000的培养皿底作培养皮肤类器官的骨架，能够促进人皮肤类器官的形成，缩短形成时间。同时调整上皮细胞间质细胞配比以及细胞数量，以及所需要培养时间及培养生长因子，具体制备步骤等，使上皮细胞和间质细胞在生长因子的诱导下形成片状、无粘附性的上皮组织结构。不仅保证了上皮细胞和间质细胞的功能，并且降低类器官构建的经济成本和时间成本。此外本专利技术制备的人皮肤类器官可用于护肤品刺激性检测，通过观察人皮肤类器官的结构变化判断添加物对上皮的刺激性。进一步的，本专利技术提供的人皮肤类器官可以检测例如抗衰，抗炎等护肤品的功效，使有效性不再拘于实验动物，通过构建人皮肤类器官，直接展现护肤品在人皮肤的有效性。
[0023]本专利技术制备的人造皮肤，在验证护肤品刺激性以及皮肤损伤模型的造模时间方面优于传统动物皮肤的试验，使用人皮肤细胞构建的皮肤类器官相比于动物皮肤更加贴近真实人皮肤状态，同时在对护肤品功效性的评价更为高效。
附图说明：
[0024]构成本专利技术的一部分的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。
[0025]在附图中：
[0026]图1为皮肤类器官形成过程图。
[0027]图2实施例2中PEG2000的释放过程。
[0028]图3实施例2中PEG2000对细胞的毒性作用。
[0029]图4实施例3中炎症因子表达情况。
[0030]图5实施例3中外界刺激对细胞的毒性实验。
[0031]图6为本专利技术制备的人皮肤类器官。
[0032]图7实施例4中A醇前后细胞衰老相关mRNA表达量的变化。
具体实施方式：
[0033]下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。在不冲突的情况下，本专利技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
[0034]在传统的测试护肤品刺激性和有效性的试验中，会采取实验动物背部涂抹法或细
胞法来验证护肤品的刺激性和有效性。但动物背部涂抹法和细胞加药法存在弊端，实验动物皮肤存在毛发保护，不能很好的模拟人的表皮。
[0035]因此，本申请提出，使用人上皮细胞(HaCaT)和人皮肤成纤维细胞系(HSF)的细胞混合液，按照合适的比例接种于琼脂糖和PEG
‑
2000的培养皿中，置于培养箱中静待细胞混合液自发形成有结构的类似于“皮肤”的片状结构。并且，本申请提出，使用合理浓度和配比的生长因子Y27632和表皮生长因子EGF可以更好的诱导细胞混合物自发形成组织结构。同时本专利技术采用琼脂
‑
PEG2000作为骨架支撑来制备皮肤类器官，利用了PEG
‑
2000可以促进细胞融合的特质，缩短皮肤类器官形成时间。同时采用琼脂与PEG
‑
2000按比例混和解决了单独使用PEG
‑
2000时其在37℃融化过快导致培养基内PEG
‑
2000浓本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人造皮肤的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：将浓度为1％
‑
1.5％的琼脂溶液，高温高压灭菌后趁热与已经融化的PEG
‑
2000混合，均匀的倒在培养皿中，铺满皿底，置于超净台中冷却至室温，获得琼脂
‑
PEG2000培养皿；S2：取HaCaT细胞与HSF细胞按细胞数量5:1
‑
10:1混合，将细胞混合液置于琼脂
‑
PEG2000培养皿中；S3：每106‑
107个混合细胞中，加入5ml含有生长因子Y27632和表皮生长因子EGF的DMEM培养基(含有5％FBS)37℃，5％CO2培养箱培养；S4：培养72h
‑
96h，细胞混合物有明显的自组织现象后，更换培养基为DMEM(含有5％FBS)继续培养；S5：换液培养72h
...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱才斌，
申请(专利权)人：上海澄穆生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：