一种新型PET替代样品垫和结合垫试纸条的制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及试纸条制备方法技术领域，提供一种新型PET替代样品垫和结合垫试纸条的制备方法及应用，本发明专利技术使用PET聚酯薄膜替代样品垫和结合垫的方法制备试纸条，不但简化了试纸条前处理工艺和组装工艺步骤，还能够提高层析过程中流体的一致性，使流体吸附减少，释放快，更加顺畅，从而减小了成品批间和批内差异，试纸条显色效果显著提升，大大提高了试纸条的重复性、特异性和灵敏度，使得双抗夹心定量产品的标准曲线中不同浓度标准物质的点分布的更加均匀，R2值更接近于1，定量结果更加准确。定量结果更加准确。定量结果更加准确。

【技术实现步骤摘要】
一种新型PET替代样品垫和结合垫试纸条的制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及试纸条制备方法
，具体涉及一种新型PET替代样品垫和结合垫试纸条的制备方法及应用。

技术介绍

[0002]免疫层析试纸条作为POCT的主流产品，传统的免疫层析试纸条包含样品垫、结合垫、NC膜(硝酸纤维素膜)、T线(检测线)、C线(质控线)、吸水纸、PVC底板七部分。样品垫常见材料有玻璃纤维膜，滤纸，无纺布，聚酯材料，其中玻璃纤维膜以其相对坚韧稳定，天然的亲水性，层析速度快，吸水量大，均一性好的优点而被广泛使用。样品垫本身可以起到过滤样品中的颗粒物质和细胞等杂质的作用，通过化学物质浸润修饰可以减小样品到达结合物释放和检测区时的差异，添加封闭物质可以减少反应膜与分析物或检测制剂之间的非特异结合，添加使样品变粘稠的物质可以降低层析速度，增加反应时间。
[0003]目前结合垫的材质还是以玻纤和聚酯为主，结合垫一般由标记有乳胶微球、胶体金颗粒或荧光微球的抗体标记复合物构成。一方面保护试剂使其干燥后在产品保质期内处于有效状态；另一方面在样本到达结合垫后，抗体标记复合物能够与待测物质结合并完全释放，保证样品能均一可靠的转移和结合NC膜(硝酸纤维素膜)上。由于传统的试纸条样品垫和结合垫是通过重叠的方式衔接的，重叠部分可能导致层析过程中阻力增大，使得成品批间和批内差异显著，导致重复性不好，若能够使用新型PET聚酯薄膜替代样品垫和结合垫，不但简化了试纸条前处理工艺和组装工艺步骤，还能够提高了试纸条的重复性、特异性和灵敏度，使定量结果更加准确。

技术实现思路

[0004]解决的技术问题
[0005]针对现有技术所存在的上述缺点，本专利技术提供了一种新型PET替代样品垫和结合垫试纸条的制备方法及应用，旨在能够通过PET聚酯薄膜替代样品垫和结合垫的方法制备试纸条，从而提高试纸条的重复性、特异性和灵敏度。
[0006]本专利技术一种新型PET替代样品垫和结合垫试纸条的制备方法，所述制备方法包括以下制备步骤：
[0007]Step1、待标记抗体蛋白溶液的制备：在4℃的条件下将待标记抗体蛋白加入至NaCl溶液中透析过夜，接着在高速冷冻离心机中以4℃、10000r/min的条件离心1h弃沉淀得蛋白溶液，然后用浓度为0.01mol/L的PBS将蛋白溶液得浓度调整到1mg/ml，所得记作待标记抗体蛋白溶液；
[0008]Step2、标记抗体蛋白的制备：所述标记抗体蛋白包括乳胶微球标记抗体蛋白、胶体金标记抗体蛋白和荧光微球标记抗体蛋白，三种标记抗体蛋白的制备过程分别为：
[0009]1)乳胶微球标记抗体蛋白的制备：使用NHS溶液和EDC溶液对乳胶微球进行活化，将待标记抗体蛋白溶液与活化后的乳胶微球按照3：1的重量比进行混合，混合后用磁力搅
拌器搅拌2
‑
8h，接着在10000r/min的条件下离心8
‑
10min留取沉淀物，使用MES缓冲溶液对沉淀物进行稀释，所得溶液即为乳胶微球标记抗体蛋白；
[0010]2)胶体金标记抗体蛋白的制备：使用K2CO3溶液将胶体金溶液和待标记抗体蛋白溶液的pH调至9，接着将100mL胶体金溶液倒入至磁力搅拌器内搅拌，加入3mL待标记抗体蛋白溶液后继续搅拌10min，接着加入5mL浓度为1％的PEG20000溶液并再次搅拌5min，以4℃、10000r/min的条件离心30min得沉淀物；将所述沉淀物悬浮于含PEG20000的MES缓冲溶液中，以上述条件再次离心后再用含PEG20000的MES缓冲溶液恢复，然后以SephadexG
‑
200柱进行凝胶层析分离纯化，纯化后以含BSA的MES缓冲溶液洗脱，所得即为胶体金标记抗体蛋白；
[0011]3)荧光微球标记抗体蛋白的制备：量取1mL浓度为10mg/mL的荧光微球加入至3mL的MES缓冲溶液中，再加入15μL的EDC溶液，振荡均匀后加入200μL待标记抗体蛋白溶液，充分混匀后室温条件下搅拌反应2h，然后加入体系1/10体积的BSA溶液封闭1h，接着以4℃、11000r/min的条件离心20min弃上清液，沉淀用3mL的MES缓冲溶液恢复后再用上述条件离心一次得沉淀物，所述沉淀物用MES缓冲溶液复溶至3mL，所得即为荧光微球标记抗体蛋白；
[0012]Step3、待组装PET的制备：将上述乳胶微球标记抗体蛋白、胶体金标记抗体蛋白和荧光微球标记抗体蛋白分别用Bio
‑
DotXYZ3050型三维喷点平台喷涂至PET聚酯薄膜上，喷涂量为3μL/cm，放入烘箱在50℃条件下干燥48h，所得即为待组装PET；
[0013]Step4、硝酸纤维素膜的制备：首先，筛选能与乳胶微球标记抗体蛋白、胶体金标记抗体蛋白和荧光微球标记抗体蛋白特异性结合的第二种特异性抗体蛋白和羊抗鼠抗体；然后，用浓度为0.01M、pH为7.3的PB缓冲液(加入3％蔗糖)将Step5中的三种第二种特异性抗体蛋白的浓度分别调节为0.6mg/mL、将Step5中的羊抗鼠抗体的浓度调节为1.0mg/mL，接着使用Bio
‑
Dot XYZ3050型三维喷点平台将所述三种第二种特异性抗体蛋白和羊抗鼠抗体包被到硝酸纤维素膜上，分别作为检测线和质控线，两线相隔5mm，喷膜量均为1.0μL/cm，放入烘箱在50℃条件下干燥48h，所得即为硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜的种类有三种，三种硝酸纤维素膜的检测线分别为筛选的能与乳胶微球标记抗体蛋白、胶体金标记抗体蛋白和荧光微球标记抗体蛋白特异性结合的第二种特异性抗体蛋白，且三种硝酸纤维素膜的质控线均为羊抗鼠抗体；
[0014]Step5、试纸条的组装：在粘性PVC底板上依次搭接地粘贴Step5中的待组装PET、Step6中的硝酸纤维素膜和吸水纸，接着用切条机切成60mm
×
4.0mm的长方形，再装在塑料卡座上，所得分别为乳胶微球标记抗体蛋白试纸条、胶体金标记抗体蛋白试纸条和荧光微球标记抗体蛋白试纸条。所述乳胶微球标记抗体蛋白试纸条、胶体金标记抗体蛋白试纸条和荧光微球标记抗体蛋白试纸条可分别安装在现有的试纸条塑料壳内组成试剂盒。
[0015]更进一步地，所述Step2中NHS溶液的制备方法为：先称取1g的2
‑
(N
‑
吗啉)乙磺酸充分溶解于90mL去离子水中，用氢氧化钠溶液调节pH值至6后，加入去离子水定容至100mL，接着称取500mg的N
‑
羟基琥珀酰亚胺充分溶解于上述混合溶液中，所得即为NHS溶液。
[0016]更进一步地，所述Step2中EDC溶液的制备方法为：先称取1g的2
‑
(N
‑
吗啉)乙磺酸充分溶解于90mL去离子水中，用氢氧化钠溶液调节pH值至6后，加入去离子水定容至100mL，接着称取500mg的1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐充分溶解于上本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新型PET替代样品垫和结合垫试纸条的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下制备步骤：Step1、待标记抗体蛋白溶液的制备：在4℃的条件下将待标记抗体蛋白加入至NaCl溶液中透析过夜，接着在高速冷冻离心机中以4℃、10000r/min的条件离心1h弃沉淀得蛋白溶液，然后用浓度为0.01mol/L的PBS将蛋白溶液得浓度调整到1mg/ml，所得记作待标记抗体蛋白溶液；Step2、标记抗体蛋白的制备：所述标记抗体蛋白包括乳胶微球标记抗体蛋白、胶体金标记抗体蛋白和荧光微球标记抗体蛋白，三种标记抗体蛋白的制备过程分别为：1)乳胶微球标记抗体蛋白的制备：使用NHS溶液和EDC溶液对乳胶微球进行活化，将待标记抗体蛋白溶液与活化后的乳胶微球按照3：1的重量比进行混合，混合后用磁力搅拌器搅拌2
‑
8h，接着在10000r/min的条件下离心8
‑
10min留取沉淀物，使用MES缓冲溶液对沉淀物进行稀释，所得溶液即为乳胶微球标记抗体蛋白；2)胶体金标记抗体蛋白的制备：使用K2CO3溶液将胶体金溶液和待标记抗体蛋白溶液的pH调至9，接着将100mL胶体金溶液倒入至磁力搅拌器内搅拌，加入3mL待标记抗体蛋白溶液后继续搅拌10min，接着加入5mL浓度为1％的PEG20000溶液并再次搅拌5min，以4℃、10000r/min的条件离心30min得沉淀物；将所述沉淀物悬浮于含PEG20000的MES缓冲溶液中，以上述条件再次离心后再用含PEG20000的MES缓冲溶液恢复，然后以SephadexG
‑
200柱进行凝胶层析分离纯化，纯化后以含BSA的MES缓冲溶液洗脱，所得即为胶体金标记抗体蛋白；3)荧光微球标记抗体蛋白的制备：量取1mL浓度为10mg/mL的荧光微球加入至3mL的MES缓冲溶液中，再加入15μL的EDC溶液，振荡均匀后加入200μL待标记抗体蛋白溶液，充分混匀后室温条件下搅拌反应2h，然后加入体系1/10体积的BSA溶液封闭1h，接着以4℃、11000r/min的条件离心20min弃上清液，沉淀用3mL的MES缓冲溶液恢复后再用上述条件离心一次得沉淀物，所述沉淀物用MES缓冲溶液复溶至3mL，所得即为荧光微球标记抗体蛋白；Step3、待组装PET的制备：将上述乳胶微球标记抗体蛋白、胶体金标记抗体蛋白和荧光微球标记抗体蛋白分别用Bio
‑
DotXYZ3050型三维喷点平台喷涂至PET聚酯薄膜上，喷涂量为3μL/cm，放入烘箱在50℃条件下干燥48h，所得即为待组装PET；Step4、硝酸纤维素膜的制备：首先，筛选能与乳胶微球标记抗体蛋白、胶体金标记抗体蛋白和荧光微球标记抗体蛋白特异性结合的第二种特异性抗体蛋白和羊抗鼠抗体；然后，用浓度为0.01M、pH为7.3的PB缓冲液(加入3％蔗糖)将Step5中的三种第二种特异性抗体蛋白的浓度分别调节为0.6mg/mL、将Step5中的羊抗鼠抗体的浓度调节为1.0mg/mL，接着使用Bio
‑
Dot XYZ3050型三维喷点平台将所述三种第二种特异性抗体蛋白和羊抗鼠抗体包被到硝酸纤维素膜上，分别作为检测线和质控线，两线相隔5mm，喷膜量均为1.0μL/cm，放入烘箱在50℃条件下干燥48h，所得即为硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜的种类有三种，三种硝酸纤维素膜的检测线分别为筛选的能与乳胶微球标记抗体蛋白、胶体金标记抗体蛋白和荧光微球标记抗体蛋白特异性结合的第二种特异性抗体蛋白，且三种硝酸纤维素膜的质控线均为羊抗鼠抗体；Step5、试纸条的组装：在粘性PVC底板上依次搭接地粘贴Step5中的待组装PET、Step6中的硝酸纤维素膜和吸水纸，接着用切条机切成60mm
×
4.0mm的长方形，再装在塑料卡座
上，所得分别为乳胶微球标记抗体蛋白试纸条、胶体金标记抗体蛋白试纸条和荧光微球标记抗体蛋白试纸条。2.根据权利要求1所述的一种新型...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁晓辉，
申请(专利权)人：上海赫景医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：