一种用于生产麦角硫因的毕赤酵母菌株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及麦角硫因合成技术领域，具体公开了一种用于生产麦角硫因的毕赤酵母菌株及其构建方法和应用。所述毕赤酵母菌株同时过表达egt1基因、egt2基因和XP_002490234基因。本发明专利技术首次在毕赤酵母中表达麦角硫因合成途径基因egt1和egt2，并同时过表达XP_002490234基因，实现麦角硫因的高效合成，并且毕赤酵母菌株可以高密度培养，调节氧化/过氧化状态，解决了毕赤酵母细胞氧化损伤削弱麦角硫因产量的问题。本发明专利技术在毕赤酵母GS115基础上转化egt1基因、egt2基因，同时过表达XP_002490234.1基因后，毕赤酵母菌株的麦角硫因产率达782mg/L，具备工业生产前景。具备工业生产前景。

【技术实现步骤摘要】
一种用于生产麦角硫因的毕赤酵母菌株及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及麦角硫因合成
，尤其是一种用于生产麦角硫因的毕赤酵母菌株及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]麦角硫因是一种硫醇化合物，又名疏基组氨酸三甲基内盐，是一种由组氨酸衍生而来的天然氨基酸衍生物，麦角硫因是一种的天然抗氧化剂，安全、无毒、高效，具有清除自由基、解毒、修复皮肤氧化损伤、调节免疫等多种生理功能，被广泛应用于食品、医药以及化妆品等领域，尤其是在美妆行业具有巨大需求。因此，麦角硫因的绿色制造具有广阔的市场前景。
[0003]利用微生物进行基因工程设计是量产各类生化产品的有效方法，目前已有利用大肠杆菌、酿酒酵母基因工程改造来生产麦角硫因的报道，均通过过表达麦角硫因合成途径基因。比如在大肠杆菌BL21(DE3)构建了两种不同来源的麦角硫因合成途径，通过异源表达耻垢分枝杆菌来源的麦角硫因合成基因簇egtBCDE，实现麦角硫因在大肠杆菌中的合成。但是大肠杆菌和酿酒酵母是较早开发用于外源基因表达的宿主系统，具有培养密度有限，分泌效率低等局限性。
[0004]迄今为止，尚无利用巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris，以下简称毕赤酵母)基因工程实现麦角硫因合成的报道，而毕赤酵母是重要的工业宿主菌，是一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌。1969年Koichi Ogata等人首次发现其利用甲醇为唯一碳源和能源生长(Ogata，et a1.1969)，此后，广泛用于生产蛋白和药物抗体，如Cregg等人首次报道了用甲醇营养型酵母表达乙型肝炎表面抗原。但是毕赤酵母高密度发酵培养条件下，存在氧化损伤胁迫，甲醇代谢中产生的活性氧物质(ROS)会攻击胞内生物分子，造成细胞损伤，此外过量表达蛋白需要消耗大量资源，比如NADPH可用性降低，这对外源蛋白表达和酶催化反应造成不利影响。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种用于生产麦角硫因的毕赤酵母菌株及其构建方法和应用。本专利技术首次在毕赤酵母中表达麦角硫因合成途径基因egt1和egt2，并同时过表达毕赤酵母GS115来源的XP_002490234基因，实现麦角硫因的高效合成，并且获得的毕赤酵母菌株可以实现高密度培养，调节氧化/过氧化状态，解决了毕赤酵母细胞氧化损伤削弱麦角硫因产量的问题。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：
[0007]第一目的，本专利技术提供了一种用于生产麦角硫因的毕赤酵母菌株，所述毕赤酵母菌株同时过表达egt1基因、egt2基因和XP_002490234基因。
[0008]本专利技术在毕赤酵母中引入麦角硫因合成途径，过量表达基因egt1和egt2，解决大肠杆菌和酿酒酵母细胞密度较低问题，并且同时过表达XP_002490234基因，可以调节氧化/
过氧化状态，解决毕赤酵母细胞氧化损伤削弱麦角硫因产量问题。
[0009]本专利技术的毕赤酵母菌株同时过表达egt1基因、egt2基因和XP_002490234基因，使得制备的毕赤酵母菌株可以实现高密度培养，并且降低了毕赤酵母菌株高密度培养时细胞氧化损伤，从而有效提高生产麦角硫因的产量(最高可达到782mg/L)，具备工业生产前景。
[0010]作为本专利技术所述毕赤酵母菌株的优选实施方式，所述egt1基因和egt2基因的来源于真菌粗糙脉胞菌(Neurospora crassa)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、皱纹土霉(Geotricum rugosum)、星状诺卡氏菌(Nocardia asteroides)和链霉菌(Streptomyces)中的一种。
[0011]作为本专利技术所述毕赤酵母菌株的优选实施方式，所述egt1基因和egt2基因的来源于真菌粗糙脉胞菌(Neurospora crassa)。
[0012]作为本专利技术所述毕赤酵母菌株的优选实施方式，所述egt1基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述egt2基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0013]作为本专利技术所述毕赤酵母菌株的优选实施方式，所述毕赤酵母菌株为毕赤酵母GS115及其衍生菌株。
[0014]毕赤酵母出发菌株P.pastoris GS115不合成麦角硫因，但转化egt1基因、egt2基因后获得的菌株(P.pastoris GS115/pPIC3.5k
‑
egt1
‑
egt2)的麦角硫因达到536mg/L，同时过表达XP_002490234.1基因后，毕赤酵母菌株(P.pastoris GS115/pPIC3.5k
‑
egt1
‑
egt2
‑
XP_002490234.1)的麦角硫因产率达782mg/L，具备工业生产前景。
[0015]第二目的，本专利技术提供了上述毕赤酵母菌株的构建方法，将过表达egt1基因、egt2基因和XP_002490234基因的表达质粒转化至毕赤酵母GS115进行诱导性表达或者组成性表达，获得用于生产麦角硫因的毕赤酵母菌株。
[0016]优选地，所述诱导性表达的具体条件为当毕赤酵母菌株的OD
600
达到50后，开始流加甲醇诱导，甲醇浓度通过气相色谱检测，使得甲醇浓度控制在0.5％以下。
[0017]作为本专利技术所述毕赤酵母菌株的构建方法的优选实施方式，所述egt1基因和egt2基因的来源于真菌粗糙脉胞菌(Neurospora crassa)。所述egt1基因和egt2基因还可以来源于粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、皱纹土霉(Geotricum rugosum)、星状诺卡氏菌(Nocardia asteroides)和链霉菌(Streptomyces)中的一种。
[0018]作为本专利技术所述毕赤酵母菌株的构建方法的优选实施方式，所述表达质粒包括pPIC3.5k或pGAPZ。本专利技术限定的表达质粒不仅仅包括pPIC3.5k或pGAPZ，包括了本领域常见的表达质粒。
[0019]第三目的，本专利技术提供了上述毕赤酵母菌株在强化麦角硫因合成中的应用。
[0020]本专利技术利用改造的毕赤酵母菌株代谢工程可以强化麦角硫因的合成，通过调节氧化/过氧化状态，降低细胞氧化损伤，有利于提高生产麦角硫因的含量；同时，本专利技术改造后的毕赤酵母菌株细胞培养的密度较高，分泌麦角硫因的效率也较高。
[0021]第四目的，本专利技术提供了上述毕赤酵母菌株在提高麦角硫因含量中的应用。
[0022]经过基因改造后的毕赤酵母菌株获得的麦角硫因总量较高，说明经过基因(egt1基因、egt2基因和XP_002490234基因)过表达，可以提高麦角硫因的总含量。
[0023]第五目的，本专利技术提供了上述一种提高麦角硫因含量的制备方法，采用上述毕赤酵母菌株作为生产菌株。采用本专利技术改造后的毕赤酵母菌株可以作为生产菌株，有效提高<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于生产麦角硫因的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述毕赤酵母菌株同时过表达egt1基因、egt2基因和XP_002490234基因。2.如权利要求1所述的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述egt1基因和egt2基因的来源于真菌粗糙脉胞菌(Neurospora crassa)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、皱纹土霉(Geotricum rugosum)、星状诺卡氏菌(Nocardia asteroides)和链霉菌(Streptomyces)中的一种。3.如权利要求2所述的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述egt1基因和egt2基因的来源于真菌粗糙脉胞菌(Neurospora crassa)。4.如权利要求3所述的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述egt1基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所...

【专利技术属性】
技术研发人员：张目，黄晓东，胡晓清，
申请(专利权)人：广州悦荟化妆品有限公司，
类型：发明
国别省市：