一种分泌辣根过氧化物酶的酿酒酵母及其发酵方法技术

本发明专利技术公开了一种分泌辣根过氧化物酶的酿酒酵母及其发酵方法，属于基因工程和发酵工程技术领域。本发明专利技术采用pGal1启动子调控HRP的表达，并配合二段式发酵使发酵120h的HRP产量达到1284U/L。进一步通过优化启动子核心区域，敲除GAL80提高pGal1及其衍生的杂合启动子(特征是具有CRM

【技术实现步骤摘要】
一种分泌辣根过氧化物酶的酿酒酵母及其发酵方法


[0001]本专利技术涉及一种分泌辣根过氧化物酶的酿酒酵母及其发酵方法，属于基因工程和发酵工程


技术介绍

[0002]辣根过氧化物酶(HRP；EC编号，1.11.1.7)是一种糖蛋白，由一条44kDa的肽链和一个血红素辅基组成，属于第三类植物过氧化物酶。由于HRP具有广谱的氧化特性，已被用于医学诊断、生物催化、生物修复和癌症治疗领域。特别是近年来，HRP被开发为强大的食品添加剂，用于蛋白质或生物聚合物的交联以及食品的保鲜杀菌。除了这些应用，HRP有可能被用于生产生物相容性支架(水凝胶)用于医学应用和可食用的微尺度支架(明胶和胶原蛋白)用于细胞培养肉。因此，随着食品制造中的应用不断增加，也需要越来越多的食品级HRP。
[0003]目前，HRP可以通过从辣根或过表达HRP的转基因植物中提取获得。但这种方法不仅生产周期较长，作物的HRP含量低，同时所获得的HRP组分也非常复杂，需要进一步纯化，因而成本高昂。相比酿酒酵母直接胞外分泌，破碎植物进而提取HRP的加工过程也更加繁琐耗能，环境成本高。也有人尝试利用大肠杆菌进行HRP的重组生产，然而由于原核生物缺乏翻译后的修饰和折叠，只能从包涵体中获得的复性HRP活性和稳定性较低，产品性质与质量远低于酿酒酵母。在常见的微生物底盘中，酿酒酵母不仅没有内毒素，也没有溶原性病毒，繁殖速度快，能进行高密度培养。更重要的是其食品安全性，不仅仅早已被人类用于面包和酿酒工业数千年，在现代也经过GRAS认证为可以用于食品工业的安全宿主。因此，应用酿酒酵母表达系统来生产HRP是最佳的选择。
[0004]利用酿酒酵母高效分泌生产HRP需要解决三个方面的难题：第一，HRP的分泌表达与菌株生长存在矛盾。HRP在进行重组表达时，由于其较大的分子量、复杂的蛋白折叠和翻译后修饰，其合成成本较高，会与生长必需蛋白的合成争夺细胞资源，进而引起酿酒酵母的代谢负担和生长抑制。尤其在对数生长期时，细胞资源更多地投入细胞生长与分裂，负责进行蛋白分泌的相关蛋白占细胞资源的比例下调。此时高强度表达异源蛋白进入分泌通路，会导致分泌通路超负荷，引起内质网错误折叠蛋白增多、氧化还原失衡等问题，诱发内质网应激反应(UPR)等一系列基因表达的调控信号，使得细胞资源重新分配，不再专注于细胞的生长与分裂，优先处理错误折叠蛋白，以求重新恢复细胞内稳态。由于在生长与分裂方面投入的细胞资源减少，加上过量表达未能及时折叠的异源蛋白对分泌途径蛋白处理能力的占用以及对分泌途径稳态的破坏，细胞的比生长速率将受损。而这一现象在HRP的生产过程中尤为严重。
[0005]第二，由于细胞资源的有限性，异源蛋白的表达强度不是越强越好，需要精细调整。一方面，天然元件相互之间的表达强度差距较大，无法精细调整异源蛋白表达在细胞资源中的占比。另一方面，即使利用人工构建的具有连续强度的表达元件库进行最适异源蛋白表达水平的筛选，依旧需要大量的测试才能选择到最优强度的元件。针对调控型表达系
统而言，通过修改序列提升整个系统开启状态下的表达强度时，其关闭状态时的严谨性也会受到影响，这进一步提升了诱导表达系统进行精细表达优化的复杂度，需要更多非理性的实验筛选才能确认最优的表达元件。从一个表达系统的组成来看，主要包括启动子，相应的转录调控因子以及终止子。启动子又进一步可以被划分为两部分：上游调控序列(CRM)和核心启动子序列(CPS)。前者主要决定整个系统的调控特性，即受什么转录调控因子或信号分子调控，调控效果是激活还是抑制，调控时机是组成型还是非组成型；后者则会影响整个表达系统的转录强度水平。转录调控因子对表达效果的影响则分为激活作用和抑制作用。终止子则主要通过影响转录本的稳定性进而影响整个表达系统的表达效果，其影响程度取决于启动子的转录强度。根据以上对调控型表达系统的理解，将有可能创制一种更理性的异源蛋白表达水平优化方式以求用更少的实验量获得目标异源蛋白的最适表达水平。
[0006]第三，针对不同异源蛋白的分泌，由于异源蛋白性质的巨大差异，适用于酿酒酵母内源蛋白分泌的信号肽对于异源蛋白的分泌不一定是最优的。由于蛋白分泌途径的本质是货物蛋白与起转运加工作用蛋白之间的相互作用。针对不同的异源分泌蛋白，由于异源分泌蛋白、异源分泌蛋白自身的信号肽以及分泌途径的转运加工蛋白这三者之间的相互作用的不同，往往采用非理性的内源信号肽替换或信号肽随机突变去筛选最优信号肽以优化异源蛋白的分泌效果，工作量巨大的同时，获得正向结果的概率较低。但从信号肽的主要组成部分看可以被划分为两个区域，一部分是pre
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peptide，主要决定异源蛋白从细胞质到内质网的易位，另一部分是pro
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peptide，主要决定异源蛋白从内质网向高尔基体的转运。根据这一原理，将有可能创制一种更理性的信号肽优化策略以降低信号肽筛选的工作量，并提高正向结果的出现概率。

技术实现思路

[0007]本专利技术针对HRP分泌表达时会引起酿酒酵母生长抑制，进而导致HRP产量严重降低等问题，提供了一种HRP产量提高的重组酿酒酵母。
[0008]本专利技术提供了一种重组酿酒酵母，表达了SEQ ID NO.47所示的辣根过氧化物酶基因。
[0009]在一种实施方式中，所述重组酿酒酵母以pESC
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URA为表达载体。
[0010]在一种实施方式中，所述辣根过氧化物酶基因连接至质粒pESC
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URA的pGal1启动子(SEQ ID NO.3)和CYC1T终止子(SEQ ID NO.4)之间。
[0011]在一种实施方式中，所述辣根过氧化物酶基因通过SEQ ID NO.3所示的pGal1启动子或SEQ ID NO.16所示的杂合启动子pCGGal7
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S调控所述辣根过氧化物酶基因的表达。
[0012]在一种实施方式中，所述重组酿酒酵母还敲除了GAL80基因；所述GAL80基因具有Gene ID:854954所示的核苷酸序列。
[0013]在一种实施方式中，所述重组酿酒酵母在酿酒酵母CEN.PK2
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1C的基础上，敲除了GAL80基因，并应用SEQ ID表NO.42～46所示启动子表达了SEQ ID NO.47所示的辣根过氧化物酶基因。
[0014]在一种实施方式中，所述CYC1T终止子被替换为SEQ ID NO.18所示的RAD14T终止子，或SEQ ID NO.25所示的HOG1T终止子，或SEQ ID NO.19所示的SYN2T终止子、或SEQ ID NO.20所示的SYN9T终止子，或SEQ ID NO.21所示的SYN10T终止子。
[0015]在一种实施方式中，所述辣根过氧化物酶基因的N端融合α信号肽序列(SEQ ID NO.2)或SEQ ID NO.26～41任一所示的优化后的信号肽。
[0016]本专利技术还提供了提高酿酒酵母辣根过氧化物酶产量的方法，包括(1)～(5)中的至少一种改进：
[本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组酿酒酵母，其特征在于，表达了SEQ ID NO.47所示的辣根过氧化物酶基因。2.根据权利要求1所述的重组酿酒酵母，其特征在于，通过SEQ ID NO.3所示的pGal1启动子或SEQ ID NO.16所示的杂合启动子pCGGal7
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S调控所述辣根过氧化物酶基因的表达。3.根据权利要求2所述的重组酿酒酵母，其特征在于，所述重组酿酒酵母还敲除了GAL80基因；所述GAL80基因具有Gene ID:854954所示的核苷酸序列。4.根据权利要求1～3任一所述的重组酿酒酵母，其特征在于，所述辣根过氧化物酶基因连接至质粒所述启动子和CYC1T终止子之间。5.根据权利要求4所述的重组酿酒酵母，其特征在于，所述CYC1T终止子被替换为SEQ ID NO.18所示的RAD14T终止子，或SEQ ID NO.25所示的HOG1T终止子，或SEQ ID NO.19所示的SYN2T终止子、或SEQ ID NO.20所示的SYN9T终止子，或SEQ ID NO.21所示的SYN10T终止子。6.根据权利要求1～5任一所述的重组酿酒酵母，其特征在于，所述辣根过氧化物酶基因的N端融合SEQ ID NO.2所示的α信号肽序列或SEQ ID NO.27～31、SEQ ID NO.40～41任一所示的优化后的信号肽。7.根据权利要求1所述的重组酿酒酵母，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵鑫锐，于海波，梁庆锋，周景文，堵国成，陈坚，李江华，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：