酿酒酵母基因工程菌及其构建方法和应用以及生产法尼烯的方法技术

本发明专利技术涉及生物工程技术领域，公开了酿酒酵母基因工程菌及其构建方法和应用以及生产法尼烯的方法，所述酿酒酵母基因工程菌包含甲羟戊酸途径中的酶的编码基因和法尼烯焦磷酸合酶编码基因，过表达了来源于莴苣(Lactuca sativa)的法尼烯合酶编码基因LsFSO，抑制了角鲨烯合酶ERG9的编码基因的表达。该酿酒酵母基因工程菌在摇瓶水平发酵72小时，可以积累3.0g/L的法尼烯，具有潜在的工业化应用价值。具有潜在的工业化应用价值。具有潜在的工业化应用价值。

【技术实现步骤摘要】
酿酒酵母基因工程菌及其构建方法和应用以及生产法尼烯的方法


[0001]本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因工程菌、一种酿酒酵母基因工程菌的构建方法、所述方法构建得到的酿酒酵母基因工程菌、所述酿酒酵母基因工程菌在生产法尼烯中的应用、一种生产法尼烯的方法。

技术介绍

[0002]法尼烯，分子式为C
15
H
24
，是一种最简单的链状倍半萜化合物。法尼烯合成可以通过法尼烯合成酶一步转化前体法尼基焦磷酸(FPP)即可完成。植物中，FPP的天然合成途径主要包括两种：甲羟戊酸(MVA)途径和2
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甲基
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D
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赤藻糖醇
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4磷酸(MEP)途径。如果单纯依赖植物提取，需要消耗大量的人力和物力，获得的法尼烯含量很低，而且成分不单一。通过代谢工程和合成生物学策略，法尼烯的微生物合成已经成功实现。
[0003]目前，利用代谢工程改造酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)合成法尼烯产量较低，CN112094765A通过在酿酒酵母中过表达截短形式的HMG
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CoA还原酶tHMG1编码基因以及过表达法尼烯焦磷酸合成酶ERG20
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来源于大豆的法尼烯合成酶Fsso的融合蛋白，获得了一株酿酒酵母基因工程菌，虽然基因工程步骤简单，但该重组菌株摇瓶水平法尼烯的产量仍较低，仅有1.0g/L。因此，仍有必要进一步获得法尼烯产量高的酿酒酵母基因工程菌。

技术实现思路

[0004]为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种利用基因工程手段构建的具备法尼烯生产能力的酿酒酵母基因工程菌FTX
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4，该酿酒酵母基因工程菌在摇瓶水平发酵可以积累3.0g/L的法尼烯，具备更高的产量，为法尼烯的工业化生产提供了有效的策略。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术第一方面提供一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因工程菌，所述酿酒酵母基因工程菌包含甲羟戊酸途径中的酶的编码基因和法尼烯焦磷酸合酶编码基因，过表达了来源于莴苣(Lactuca sativa)的法尼烯合酶编码基因LsFSO，抑制了角鲨烯合酶ERG9的编码基因的表达。
[0006]优选地，所述来源于莴苣(Lactuca sativa)的法尼烯合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；和/或
[0007]来源于莴苣(Lactuca sativa)的法尼烯合成酶编码基因LsFSO的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0008]本专利技术第二方面提供一种酿酒酵母基因工程菌的构建方法，以酿酒酵母为出发菌株，通过过表达甲羟戊酸途径中的酶的编码基因和法尼烯焦磷酸合酶编码基因，过表达来源于莴苣(Lactuca sativa)的法尼烯合酶编码基因LsFSO，抑制角鲨烯合酶ERG9的编码基因的表达，得到酿酒酵母基因工程菌。
[0009]本专利技术第三方面提供如上所述的方法构建得到的酿酒酵母基因工程菌。
[0010]本专利技术第四方面提供如上所述的酿酒酵母基因工程菌在生产法尼烯中的应用。
[0011]本专利技术第五方面提供一种生产法尼烯的方法，该方法包括将如上所述的酿酒酵母基因工程菌接种到发酵培养基中进行发酵并生产法尼烯，其中，所述发酵培养基中含有甲硫氨酸。
[0012]本专利技术中利用基因工程手段构建了能够生产法尼烯的酿酒酵母基因工程菌FTX
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4，其过表达甲羟戊酸途径中的酶基因和法尼烯焦磷酸合酶基因以及来自莴苣来源的法尼烯合酶编码基因LsFSO，同时抑制角鲨烯合酶erg9的编码基因表达，使得在摇瓶水平发酵能够积累3.0g/L的法尼烯，为法尼烯的工业化生产提供了有效的策略。
附图说明
[0013]图1示出了法尼烯合成流程示意图，其中，蓝色实线箭头表示本专利技术中过表达的甲羟戊酸途径中的酶的编码基因和法尼烯焦磷酸合酶编码基因，红色虚线表示本专利技术中抑制的erg9基因，绿色实线箭头表示本专利技术中过表达的外源基因LsFSO。
具体实施方式
[0014]在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
[0015]本专利技术第一方面提供一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因工程菌，所述酿酒酵母基因工程菌包含甲羟戊酸途径中的酶的编码基因和法尼烯焦磷酸合酶编码基因，过表达了来源于莴苣(Lactuca sativa)的法尼烯合酶编码基因LsFSO，抑制了角鲨烯合酶ERG9的编码基因的表达。
[0016]所述来源于莴苣(Lactuca sativa)的法尼烯合成酶的GenBank号优选为XP_023749309.1，优选地，所述来源于莴苣(Lactuca sativa)的法尼烯合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。其编码基因按照酿酒酵母的密码子偏好性进行优化，优化基因命名为LsFSO，优选地，来源于莴苣(Lactuca sativa)的法尼烯合成酶编码基因LsFSO的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0017]优选地，所述酿酒酵母基因工程菌过表达了甲羟戊酸途径中的酶的编码基因和法尼烯焦磷酸合酶编码基因中的至少一个。甲羟戊酸途径中的酶的编码基因可以扩增自酿酒酵母基因组DNA，扩增时可以包含其自身的终止子。本专利技术中可以通过染色体整合或者转入质粒等方式实现甲羟戊酸途径中的酶的编码基因和法尼烯焦磷酸合酶编码基因中的至少一个基因的过表达。
[0018]优选地，所述酿酒酵母基因工程菌包括至少一个拷贝的Acetyl
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CoA乙酰基转移酶编码基因erg10、至少一个拷贝的HMG
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CoA合成酶编码基因erg13、至少三个拷贝的截短形式的HMG
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COA还原酶编码基因tHMG1、至少两个拷贝的甲羟戊酸激酶编码基因erg12、至少一个拷贝的磷酸甲羟戊酸激酶编码基因erg8、至少一个拷贝的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶编码基因mvd1、至少一个拷贝的异戊二烯焦磷酸δ
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异构酶编码基因idi1和至少一个拷贝的法尼烯焦磷酸合酶编码基因erg20。
[0019]优选地，所述甲羟戊酸途径中的酶的编码基因和所述法尼烯焦磷酸合酶编码基因的启动子各自独立地为GAL启动子。GAL启动子可以扩增自酿酒酵母基因组DNA，如GAL10和GAL1启动子。
[0020]为了配合过表达甲羟戊酸途径中的酶的编码基因和所述法尼烯焦磷酸合酶编码基因使用的GAL启动子，可以利用葡萄糖解阻遏的启动子P
GAL4
‑
M
过表达了GAL本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母基因工程菌包含甲羟戊酸途径中的酶的编码基因和法尼烯焦磷酸合酶编码基因，过表达了来源于莴苣(Lactuca sativa)的法尼烯合酶编码基因LsFSO，抑制了角鲨烯合酶ERG9的编码基因的表达。2.根据权利要求1所述的酿酒酵母基因工程菌，其中，所述来源于莴苣(Lactuca sativa)的法尼烯合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；和/或来源于莴苣(Lactuca sativa)的法尼烯合成酶编码基因LsFSO的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。3.根据权利要求1或2所述的酿酒酵母基因工程菌，其中，所述酿酒酵母基因工程菌过表达了甲羟戊酸途径中的酶的编码基因和法尼烯焦磷酸合酶编码基因中的至少一个；优选地，所述酿酒酵母基因工程菌包括至少一个拷贝的Acetyl
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CoA乙酰基转移酶编码基因erg10、至少一个拷贝的HMG
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CoA合成酶编码基因erg13、至少三个拷贝的截短形式的HMG
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COA还原酶编码基因tHMG1、至少两个拷贝的甲羟戊酸激酶编码基因erg12、至少一个拷贝的磷酸甲羟戊酸激酶编码基因erg8、至少一个拷贝的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶编码基因mvd1、至少一个拷贝的异戊二烯焦磷酸δ
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异构酶编码基因idi1和至少一个拷贝的法尼烯焦磷酸合酶编码基因erg20；优选地，所述甲羟戊酸途径中的酶的编码基因和所述法尼烯焦磷酸合酶编码基因的启动子各自独立地为GAL启动子；优选地，所述酿酒酵母基因工程菌中包含利用葡萄糖解阻遏的启动子P
GAL4
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M
过表达的GAL4基因。4.根据权利要求1所述的酿酒酵母基因工程菌，其中，角鲨烯合酶编码基因erg9的启动子是甲硫氨酸抑制的启动子P
MET3
。5.根据权利要求1
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4中任意一项所述的酿酒酵母基因工程菌，其中，所述酿酒酵母基因工程菌以酿酒酵母CEN.PK2
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1D为宿主。6.一种酿酒酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，以酿酒酵母为出发菌株，通过过表达甲羟戊酸途径中的酶的编码基因和法尼烯焦磷酸合酶编码基因，过表达来源于莴苣(Lactuca sativa)的法尼烯合酶编码基因L...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈玲，王凌旭，路飞，冀勇良，
申请(专利权)人：上海博纳赛恩医药研发有限公司，
类型：发明
国别省市：