包含IL-12和抗FAP抗体的融合蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种双特异性抗体，其包含特异性结合FAP的抗原结合位点和IL

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含IL
‑
12和抗FAP抗体的融合蛋白及其应用


[0001]本专利技术涉及包含IL
‑
12或其变体和抗FAP抗体的新型融合蛋白，以及包含所述融合蛋白的抗癌药物组合物。

技术介绍

[0002]白细胞介素
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12(IL
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12)是一种具有代表性的炎性细胞因子，在有效诱导细胞免疫应答中起着至关重要的作用。IL
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12是一种异二聚体蛋白，其包含通过二硫键连接的40kDa(p40)和35kDa(p35)亚基，由活化的巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞和活化的B淋巴细胞产生。IL
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12可增强辅助性T细胞1(T
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helper 1cell)的免疫，增加细胞T淋巴细胞的细胞毒性，并抑制血管生成。一般来说，IL
‑
12激活T细胞和NK细胞中IFN
‑
γ的产生。
[0003]IL
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12的局部表达使肿瘤细胞对T细胞介导的细胞毒性敏感，导致肿瘤生长抑制和体液免疫的建立。然而，IL
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12临床应用的缺点是，给药后可能发生全身性的细胞因子相关的毒性。这些临床结果表明，IL
‑
12作为治疗癌症的单一药物的局限性。
[0004]另一方面，成纤维细胞活化蛋白α(FAP)是一种在活化的成纤维细胞上表达的明胶酶。已知FAP在各种人类癌症(包括前列腺癌和胰腺癌)的癌症相关成纤维细胞中的表达超过90％。因此，最近开发针对FAP表达细胞的免疫疗法的兴趣正在迅速增加(Fang J等人，Mol.Ther.Oncolytics，3:16007，2016)。

技术实现思路

[0005]技术问题
[0006]因此，本专利技术人已经研究开发出一种具有抗癌作用的新型融合蛋白。结果，本专利技术人发现包含IL
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12和抗FAP抗体的融合蛋白提高了抗癌活性，同时降低全身毒性，从而完成了本专利技术。
[0007]问题的解决方案
[0008]在本专利技术的一个方面，提供了一种融合蛋白，其包括包含IL
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12或其变体的第一单体；和包含特异性结合FAP的抗原结合位点的第二单体。
[0009]在本专利技术的另一方面，提供了一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含所述融合蛋白作为活性成分。
[0010]在本专利技术的另一方面，提供了一种编码所述第一单体的多核苷酸。
[0011]在本专利技术的另一方面，提供了一种编码所述第二单体的多核苷酸。
[0012]在本专利技术的另一方面，提供了一种包含所述多核苷酸的载体。
[0013]在本专利技术的另一方面，提供了一种已将所述载体引入其中的转化细胞。
[0014]在本专利技术的另一方面，提供了一种产生融合蛋白的方法，其包括i)培养所述转化细胞；和ii)回收包含所述第一单体和所述第二单体的融合蛋白。
[0015]在本专利技术的另一方面，提供了一种治疗或预防癌症的方法，其包括向受试者施用一种融合蛋白，其包含含有IL
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12或其变体的第一单体，和包含特异性结合FAP的抗原结合
位点的第二单体。
[0016]在本专利技术的另一方面，提供了一种融合蛋白，其包含含有IL
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12或其变体的第一单体和包含特异性结合FAP的抗原结合位点的第二单体在治疗癌症中的应用。
[0017]在本专利技术的另一方面，提供了一种融合蛋白，其包含含有IL
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12或其变体的第一单体和包含特异性结合FAP的抗原结合位点的第二单体在制备用于治疗癌症的药物中的应用。
[0018]专利技术效果
[0019]包含IL
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12和特异性结合FAP的抗原结合位点的融合蛋白可能通过IL
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12表现出抗癌作用。此外，还发现，当抗FAP抗体在一种抗体中实施时，IL
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12在具有高FAP表达的肿瘤中特异性积累，从而降低全身性毒性并表现出肿瘤特异性抗癌效果。也就是说，通过特异性靶向肿瘤中高表达的FAP，并将IL
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12特异性定位到肿瘤部位，可以有效地治疗癌症。
附图说明
[0020]图1示出了根据实施方案，通过SDS
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PAGE鉴定T1.01、T1.02、T1.03、T1.04、T1.05、T1.06和T1.07获得的结果。
[0021]图2示出了根据实施方案，通过SDS
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PAGE鉴定T1.08、T1.09、T1.10、T1.11、T1.12、T1.13、T1.14和T1.15获得的结果。
[0022]图3示出了根据实施方案，通过SDS
‑
PAGE鉴定T1.16、T1.17、T1.18、T1.19和T1.21获得的结果。
[0023]图4示出了根据实施方案，通过SDS
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PAGE鉴定T1.01m、T1.02m、T1.03m、T1.04m、T1.05m、T1.06m和T1.07m获得的结果。
[0024]图5示出了根据实施方案，通过SDS
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PAGE鉴定T1.08m、T1.09m、T1.10m、T1.11m、T1.12m、T1.13m和T1.15m获得的结果。
[0025]图6示出了根据实施方案，通过SDS
‑
PAGE鉴定T1.16m、T1.17m、T1.18m、T1.19m、T1.20m、T1.21m和T1.22m获得的结果。
[0026]图7示出了通过表面等离子体共振分析方法显示T1.01和T1.02与人重组FAP(rhFAP)的结合亲和力的图。
[0027]图8示出了通过表面等离子体共振分析方法显示T1.03与人重组FAP的结合亲和力的图。
[0028]图9示出了通过表面等离子体共振分析方法显示T1.04和T1.05与人重组FAP的结合亲和力的图。
[0029]图10示出了通过表面等离子体共振分析方法显示T1.06和T1.07与人重组FAP的结合亲和力的图。
[0030]图11示出了通过表面等离子体共振分析方法显示T1.08和T1.09与人重组FAP的结合亲和力的图。
[0031]图12示出了通过表面等离子体共振分析方法显示T1.10和T1.11与人重组FAP的结合亲和力的图。
[0032]图13示出了通过表面等离子体共振分析方法显示T1.01m和T1.02m与小鼠重组FAP的结合亲和力的图。
[0033]图14示出了通过表面等离子体共振分析方法显示T1.03m与小鼠重组FAP的结合亲和力的图。
[0034]图15示出了通过流式细胞术显示T1.12、T1.01、T1.02和T1.03与HEK293
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hFAP细胞和HEK293细胞的结合亲和力的图。
[0035]图16示出了通过流式细胞术显示T1.12m、T1.01m、T本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种融合蛋白，其包括：包含IL
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12或其变体的第一单体；和包含特异性结合FAP(成纤维细胞活化蛋白α)的抗原结合位点的第二单体。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，IL
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12或其变体包含IL
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12A(p35)或其变体；和IL
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12B(p40)或其变体。3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述IL
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12或其变体包含以下结构式(I)或(II)：N'
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Y
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[接头(1)]o
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Z
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C'(I)N'
‑
Z
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[接头(1)]o
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Y
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C'(II)在结构式(I)和(II)中，N'为融合蛋白的N末端，C'为融合蛋白的C末端，Y为IL
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12A或其变体，Z为IL
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12B或其变体，所述接头(1)为肽接头，并且o为0或1。4.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述IL
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12B(p40)的变体包含在如SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列中通过取代选自由K258A、K260A、K263A和K264A组成的组中的至少一个而获得的氨基酸序列。5.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述IL
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12B(p40)包含如SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:86所示的氨基酸序列。6.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述IL
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12B(p40)的变体包含如SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:89或SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列。7.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述IL
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12A(p35)包含如SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:87所示的氨基酸序列。8.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述IL
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12包含如SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:88或SEQ ID NO:90所示的氨基酸序列。9.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述特异性结合FAP的抗原结合位点包括：包含如SEQ ID NO:96所示的HCDR1，如SEQ ID NO:97所示的HCDR2和如SEQ ID NO:98所示的HCDR3的重链可变区，以及包含如SEQ ID NO:99所示的LCDR1，如SEQ ID NO:100所示的LCDR2和如SEQ ID NO:101所示的LCDR3的轻链可变区；包含如SEQ ID NO:104所示的HCDR1，如SEQ ID NO:105所示的HCDR2和如SEQ ID NO:106所示的HCDR3的重链可变区，以及包含如SEQ ID NO:107所示的LCDR1，如SEQ ID NO:108所示的LCDR2和如SEQ ID NO:109所示的LCDR3的轻链可变区；包含如SEQ ID NO:127所示的HCDR1，如SEQ ID NO:128所示的HCDR2和如SEQ ID NO:129所示的HCDR3的重链可变区，以及包含如SEQ ID NO:130所示的LCDR1，如SEQ ID NO:131所示的LCDR2和如SEQ ID NO:132所示的LCDR3的轻链可变区；
包含如SEQ ID NO:133所示的HCDR1，如SEQ ID NO:134所示的HCDR2和如SEQ ID NO:135所示的HCDR3的重链可变区，以及包含如SEQ ID NO:136所示的LCDR1，如SEQ ID NO:137所示的LCDR2和如SEQ ID NO:138所示的LCDR3的轻链可变区；包含如SEQ ID NO:139所示的HCDR1，如SEQ ID NO:140所示的HCDR2和如SEQ ID NO:141所示的HCDR3的重链可变区，以及包含如SEQ ID NO:142所示的LCDR1，如SEQ ID NO:143所示的LCDR2和如SEQ ID NO:144所示的LCDR3的轻链可变区；包含如SEQ ID NO:145所示的HCDR1，如SEQ ID NO:146所示的HCDR2和如SEQ ID NO:147所示的HCDR3的重链可变区，以及包含如SEQ ID NO:148所示的LCDR1，如SEQ ID NO:149所示的LCDR2和如SEQ ID NO:150所示的LCDR3的轻链可变区；包含如SEQ ID NO:151所示的HCDR1，如SEQ ID NO:152所示的HCDR2和如SEQ ID NO:153所示的HCDR3的重链可变区，以及包含如SEQ ID NO:154所示的LCDR1，如SEQ ID NO:155所示的LCDR2和如SEQ ID NO:156所示的LCDR3的轻链可变区；一个包含如SEQ ID NO:157所示的HCDR1，如SEQ ID NO:158所示的HCDR2和如SEQ ID NO:159所示的HCDR3的重链可变区，以及包含如SEQ ID NO:160所示的LCDR1，如SEQ ID NO:161所示的LCDR2和如SEQ ID NO:162所示的LCDR3的轻链可变区；包含如SEQ ID NO:163所示的HCDR1，如SEQ ID NO:164所示的HCDR2和如SEQ ID NO:165所示的HCDR3的重链可变区，以及包含如SEQ ID NO:166所示的LCDR1，如SEQ ID NO:167所示的LCDR2和如SEQ ID NO:168所示的LCDR3的轻链可变区；包含如SEQ ID NO:169所示的HCDR1，如SEQ ID NO:170所示的HCDR2和如SEQ ID NO:171所示的HCDR3的重链可变区，以及包含如SEQ ID NO:172所示的LCDR1，如SEQ ID NO:173所示的LCDR2和如SEQ ID NO:174所示的LCDR3的轻链可变区；包含如SEQ ID NO:175所示的HCDR1，如SEQ ID NO:176所示的HCDR2和如SEQ ID NO:177所示的HCDR3的重链可变区，以及包含如SEQ ID NO:178所示的LCDR1，如SEQ ID NO:179所示的LCDR2和如SEQ ID NO:180所示的LCDR3的轻链可变区；包含如SEQ ID NO:181所示的HCDR1，如SEQ ID NO:182所示的HCDR2和如SEQ ID NO:183所示的HCDR3的重链可变区，以及包含如SEQ ID NO:184所示的LCDR1，如SEQ ID NO:185所示的LCDR2和如SEQ ID NO:186所示的LCDR3的轻链可变区；包含如SEQ ID NO:187所示的HCDR1，如SEQ ID NO:188所示的HCDR2和如SEQ ID NO:189所示的HCDR3的重链可变区，以及包含如SEQ ID NO:190所示的LCDR1，如SEQ ID NO:191所示的LCDR2和如SEQ ID NO:192所示的LCDR3的轻链可变区；包含如SEQ ID NO:193所示的HCDR1，如SEQ ID NO:194所示的HCDR2和如SEQ ID NO:195所示的HCDR3的重链可变区，以及包含如SEQ ID NO:196所示的LCDR1，如SEQ ID NO:197所示的LCDR2和如SEQ ID NO:198所示的LCDR3的轻链可变区；包含如SEQ ID NO:199所示的HCDR1，如SEQ ID NO:200所示的HCDR2和如SEQ ID NO:201所示的HCDR3的重链可变区，以及包含如SEQ ID NO:202所示的LCDR1，如SEQ ID NO:203所示的LCDR2和如SEQ ID NO:204所示的LCDR3的轻链可变区；包含如SEQ ID NO:205所示的HCDR1，如SEQ ID NO:206所示的HCDR2和如SEQ ID NO:207所示的HCDR3的重链可变区，以及包含如SEQ ID NO:208所示的LCDR1，如SEQ ID NO:209所示的LCDR2和如SEQ ID NO:210所示的LCDR3的轻链可变区；
包含如SEQ ID NO:211所示的HCDR1，如SEQ ID NO:212所示的HCDR2和如SEQ ID NO:213所示的HCDR3的重链可变区，以及包含如SEQ ID NO:214所示的LCDR1，如SEQ ID NO:215所示的LCDR2和如SEQ ID NO:216所示的LCDR3的轻链可变区；包含如SEQ ID NO:217所示的HCDR1，如SEQ ID NO:218所示的HCDR2和如SEQ ID NO:219所示的HCDR3的重链可变区，以及包含如SEQ ID NO:220所示的LCDR1，如SEQ ID NO:221所示的LCDR2和如SEQ ID NO:222所示的LCDR3的轻链可变区；包含如SEQ ID NO:223所示的HCDR1，如SEQ ID NO:224所示的HCDR2和如SEQ ID NO:225所示的HCDR3的重链可变区，以及包含如SEQ ID NO:226所示的LCDR1，如SEQ ID NO:227所示的LCDR2和如SEQ ID NO:228所示的LCDR3的轻链可变区；包含如SEQ ID NO:229所示的HCDR1，如SEQ ID NO:230所示的HCDR2和如SEQ ID NO:231所示的HCDR3的重链可变区，以及包含如SEQ ID NO:232所示的LCDR1，如SEQ ID NO:233所示的LCDR2和如SEQ ID NO:234所示的LCDR3的轻链可变区；包含如SEQ ID NO:235所示的HCDR1，如SEQ ID NO:236所示的HCDR...

【专利技术属性】
技术研发人员：金东建，柳秀旼，李多憓，金东秀，张志勋，李秉喆，
申请(专利权)人：治纳辅医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：