一种扩增速度可控的PCR装置及其构建方法和运用制造方法及图纸

一种扩增速度可控的PCR装置及其构建方法和运用，首先，将成胶粉剂均匀混合溶解；其次，取上述混合溶液与DNA聚合酶混匀；最后，加热反应成胶。本发明专利技术在普通PCR和实时定量荧光PCR中通用，不改变原有的设备装置。本发明专利技术运用到实时定量荧光PCR，通过监控扩增速度，最终校准CT值，提高检测准确度；运用到普通PCR，通过调控扩增速度，延长到达扩增平台期的循环周期，提高以扩增DNA终浓度检测分析初始模板浓度的灵敏度。敏度。敏度。

【技术实现步骤摘要】
一种扩增速度可控的PCR装置及其构建方法和运用
[0001]

[0002]本专利技术属于核酸扩增及核酸检测
，具体涉及一种扩增速度可控的PCR装置及其在实现更加精准的检测分析初始DNA模板浓度中的应用。
[0003]
技术介绍

[0004]聚合酶链反应(PCR)是二十世纪最伟大的专利技术之一，已广泛应用于医学和生物学领域。由于PCR具有较高的灵敏度、特异性和速度，核酸检测一直是确诊阳性病例最重要的方法之一。现代分子生物学技术的发展，如DNA测序和分子克隆，都离不开PCR。也就是说，聚合酶链反应(PCR)的进展使分子生物学技术发生了革命性的变化。
[0005]1985年，K.B. Mullis描述了PCR技术的原理和最初的概念:在试管中模拟细胞内的DNA复制，合成单链DNA(寡核苷酸)的短长度和特定序列，将DNA模板、引物、dNTP和聚合酶混合在合适的缓冲溶液中，变性、退火和延伸的温度循环催化不断合成新的互补DNA链。我们都知道，高拷贝数的DNA序列经过特异性扩增后，最重要的一步就是它们的检测分析。为了实现绝对定量，PCR技术经历了常规PCR、实时荧光定量PCR (RT
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PCR)和数字PCR (dPCR)三个阶段。第一代常规PCR采用琼脂糖凝胶电泳分析其最终产物，但仅适用于定性分析和半定量分析。缺点是灵敏度和重现性较差。经过指数扩增后，DNA产物不再增加，即平台期，因此不能从最终产物推断出DNA的初始含量。为了实时监测整个反应过程，在PCR反应体系中加入荧光染料，这就是俗称的第二代PCR，即实时荧光定量PCR。经过一定次数的循环放大后，荧光信号达到一个阈值，此时的周期数称为周期阈值(cycle threshold, CT)。根据其与CT值的线性关系，可以定量分析初始DNA含量。但在PCR反应体系中，高荧光背景、抑制剂含量以及目标序列的低含量和略有差异导致灵敏度和准确性的限制。目前，PCR已经发展到第三代数字PCR (digital PCR,dPCR)，是一种灵敏度高、绝对定量的核酸分析技术。一个DNA样本被分成几十个到数万个，分配到不同的PCR反应室。每个只包含一个或不包含一个DNA分子的小室可以单独进行PCR反应。使用基于泊松分布的统计分析计算DNA的初始量。这是一种绝对定量的方法，不需要内源性控制、参考样本或生成标准曲线。但dPCR具有成本高、通量有限、操作复杂等典型缺点。
[0006]快速、简单、经济、高灵敏度的PCR发展从未停止，许多特殊类型的PCR也发展起来，如逆转录PCR、巢式PCR、多重PCR、不对称PCR等，以适应某些特殊的需要。在分子生物学实验室中，常规PCR和实时qPCR是鉴定基因及其差异表达的最常用方法。因此，对两代PCR技术进行改进是非常有意义的，例如提高灵敏度和准确度。
[0007]
技术实现思路

[0008]解决的技术问题：在普通PCR中，指数扩增后，DNA产物不再增加，从最终产物推断
DNA的初始浓度的特异性灵敏度较差。通过本专利技术的扩增速度可控的PCR装置可延长DNA扩增的周期，并保持一定范围内的线性扩增，从而提高DNA的初始浓度的特异性灵敏度。此外，在实时定量荧光PCR反应体系中，高荧光背景、抑制剂含量以及目标序列的低含量和略有差异导致灵敏度和准确性的限制。通过本专利技术的扩增速度可控的PCR装置，在一定范围内保持线性扩增，这样可以检测反应速率，对周期阈值(cycle threshold, CT)进行校准，更加精准定量检测DNA的初始浓度。第三，制备水凝胶转载DNA聚合酶更好保护酶免受抑制剂的影响，如荧光物质，从而可以提高荧光物质的含量，增加检测的灵敏度。
[0009]技术方案：一种扩增速度可控的PCR装置的构建方法，构建步骤为：首先，配制不同浓度的动物血清白蛋白或者胶原蛋白，再加入DNA聚合酶、模板、引物、镁离子、PCR反应缓冲液和去离子水，所述终溶液中动物血清白蛋白浓度为2.5 mg/mL至50 mg/mL；然后，高温加热成胶制备扩增速度可控的PCR装置。
[0010]具体方案为，配制质量浓度为20%的成胶溶液；配制10
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PCR缓冲液： 100 mM 25℃ pH 8.8 Tris
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HCl，500 mM KCl， 0.8%(v/v) Nonidet P40；MgCl2：15 mM；DNA聚合酶：Taq DNA 聚合酶或热启动Taq DNA聚合酶，dNTP：2.5 mM，上游引物：10 mM，下游引物：10 mM，DNA模板：cDNA；将成胶溶液：0.5
‑
2μL，10
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PCR缓冲液：2μL，MgCl2：2μL，DNA聚合酶：0.1μL，dNTP：2.5 mM，上游引物10 mM：0.1
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0.5 μL ，下游引物10 mM：0.1
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0.5 μL，DNA模板：cDNA 5μL，补充去离子水至20μL 积的液体置于PCR仪中95℃加热5 min；通过调节胶溶液的浓度，或调节模板和引物浓度，控制扩增速度。
[0011]上述成胶溶液为动物血清白蛋白或胶原蛋白质。
[0012]上述构建方法制得的扩增速度可控的PCR装置。
[0013]上述装置在检测分析初始DNA模板浓度中的应用。
[0014]上述装置在扩增速度可控PCR中的应用。
[0015]有益效果：本专利技术在普通PCR和实时定量荧光PCR中通用，不改变原有的设备装置。PCR技术目前在分子生物实验室运用很广，如果在没有配制荧光PCR仪器的实验室，亦可以通过普通PCR仪精准半定量分析基因表达差异，从而发现目前通过普通PCR无法发现的基因表达差异。普通PCR增加基因表达差异检测的灵敏度，可以很大程度降低成本，实现更廉价的PCR检测基因表达差异。本专利技术运用到实时定量荧光PCR，通过监控扩增速度，最终校准CT值，提高检测准确度。
[0016]附图说明
[0017]图1为（A）扩增速度可控PCR的扩增曲线，(B) 扩增速度可控PCR扩增20、35和65循环后；PCR反应体系过程可见实施例1。
[0018]图2为荧光PCR的扩增曲线，线性拟合尺不同周期循环后的R2值，扩增速度可控PCR具有更好线性关系，说明其在这个范围了为线性扩增，原因是通过控制酶的释放，调控了扩增速度；对实施例1中的数据分析。
[0019]图3为进一步验证扩增速度可控PCR理论依据，（A）假设酶的活性从PCR开始就降低，其扩增曲线明显右移，但在扩增速度可控PCR中只有稍微右移；（B）荧光PCR中CT值和PCR中扩增效率的关系；（C）扩增速度可控PCR中CT值和PCR中扩增效率的关系；则说明扩增速度
可控PCR在后期可以通过调节酶的释放控制PCR扩增速度；对实施例1中的数据分析。
[0020]图4为不同循环周期后，（A）剩余存在凝胶中的酶继续PCR后扩增曲线，（B）从凝胶中释放的DNA聚合酶酶继续PCR后的扩增曲线；这可以充分证明DNA聚合酶在PCR循环周本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种扩增速度可控的PCR装置的构建方法，其特征在于，构建步骤为：首先，配制不同浓度的动物血清白蛋白或者胶原蛋白，再加入DNA聚合酶、模板、引物、镁离子、PCR反应缓冲液和去离子水，所述终溶液中动物血清白蛋白浓度为2.5 mg/mL至50 mg/mL；然后，高温加热成胶制备扩增速度可控的PCR装置。2.根据权利要求1所述扩增速度可控的PCR装置的构建方法，其特征在于，配制质量浓度为20%的成胶溶液；配制10
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PCR缓冲液： 100 mM 25℃ pH 8.8 Tris
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HCl，500 mM KCl， 0.8% (v/v) Nonidet P40；MgCl2：15 mM；DNA聚合酶：Taq DNA 聚合酶或热启动Taq DNA聚合酶，dNTP：2.5 mM，上游引物：10 mM，下游引物：10 mM，DNA模板：cDNA；将成胶溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋兴禄，
申请(专利权)人：广西医科大学，
类型：发明
国别省市：