人多能干细胞衍生的心脏基质细胞的大量生产制造技术

本申请描述了从多能干细胞产生心脏基质细胞群的方法。具体地，该方法涉及(i)诱导多能干细胞衍生的心外膜细胞的上皮间充质转化和(ii)在无血清条件下扩增心脏基质细胞的数量。这些心脏基质细胞可以根据所述方法大量生产，并且所述细胞在至少80％的心脏基质细胞中保持CD90、CD73和CD44的表达。此外，本申请涉及心脏基质细胞群，它们是多能干细胞衍生的，并且其中至少80％的心脏基质细胞表达CD90、CD73和CD44。所述心脏基质形成若干体外和体内应用的基础，例如工程器官组织的生产和例如心脏修复的支持。此外，本文提供了用于扩增心脏基质细胞的无血清培养基。胞的无血清培养基。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】人多能干细胞衍生的心脏基质细胞的大量生产

技术介绍

[0001]心脏由心肌细胞和非肌细胞组成。心脏的非肌细胞部分主要包括基质细胞、内皮细胞和白细胞(Naito等人，2006，Pinto等人，2016，Zhou和Pu 2016)。心脏基质细胞，也称为驻留间充质细胞(Pinto等人，2016)，主要包括成纤维细胞或成纤维细胞样细胞。心脏成纤维细胞的发育起源仍存在争议，但似乎主要来自心外膜(Ivey和Tallquist 2016)。心外膜是心脏的最外层。它是在胚胎心脏的循环阶段从前心外膜器官发育而成(Witty等人，(2014))。具体地，前心外膜包裹心脏，形成一个外部上皮层，即心外膜。然后，心外膜响应各种信号(包括TGFβ1、Wnt、视黄酸(RA)、FGF和PDGF)发生上皮
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间充质转化(EMT)，从而产生侵入心肌层的心脏成纤维细胞和冠状血管平滑肌细胞，为发育中的心脏的结构和血管群作出贡献。这些细胞也被称为心脏基质细胞(或心外膜衍生的细胞)，在心肌层内的非心肌细胞群中占很大比例(Witty等人(2014))。发现心外膜衍生的成纤维细胞和心肌细胞之间的旁分本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.从多能干细胞产生心脏基质细胞群的方法，所述方法包括以下步骤：i.诱导通过多能干细胞的分化获得的心外膜细胞的上皮间充质转化，其中所述心外膜细胞表达Wilms肿瘤抗原(WT
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1)，其中通过诱导上皮间充质转化，心外膜细胞分化为心脏基质细胞，其中诱导上皮间充质转化包括a1)在无血清基础培养基中在存在第一细胞外基质蛋白的情况下在合适条件下培养所述心外膜细胞；随后a2)在无血清基础培养基中，在存在第二细胞外基质蛋白的情况下在合适条件下培养步骤(i)a1)的细胞；其中至少约80％的所获得的心脏基质细胞群的细胞表达CD90、CD73和CD44；以及ii.通过在无血清基础培养基中在存在至少一种第三细胞外基质蛋白的情况下培养步骤(i)的所述心脏基质细胞群来扩增所述心脏基质细胞的数量，其中所述心脏基质细胞群中至少80％的细胞保持CD90、CD73和CD44的表达。2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(ii)稳定地扩增心脏基质细胞群，通过至少80％保持CD90、CD73和CD44的表达来确定，优选至少81％、更优选至少82％、甚至更优选至少83％、甚至更优选至少84％、甚至更优选至少85％、甚至更优选至少86％、甚至更优选至少87％、甚至更优选至少88％、甚至更优选至少89％、且最优选地至少90％，通过流式细胞术测定。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法包括以下步骤：i.诱导通过多能干细胞的分化获得的心外膜细胞的上皮间充质转化，其中所述心外膜细胞表达Wilms肿瘤抗原(WT
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1)，其中通过诱导上皮间充质转化，心外膜细胞分化为心脏基质细胞，其中诱导上皮间充质转化包括a1)在无血清基础培养基中在存在第一细胞外基质蛋白的情况下在合适条件下培养所述心外膜细胞，所述无血清基础培养基包含有效量的(a)FGF2、(b)血管内皮生长因子(VEGF)、(c)谷氨酰胺和(d)GSK
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3抑制剂，其中所述量导致CD90在至少50％的由步骤(i)a1)获得的细胞中表达，CD73在至多50％的由步骤(i)a1)获得的细胞中表达，以及CD44在至多30％的由步骤(i)a1)获得的细胞中表达；随后a2)在无血清基础培养基中在存在第二细胞外基质蛋白的情况下在合适条件下培养步骤(i)a1)的所述细胞，所述无血清基础培养基包含有效量的(a)FGF2、(b)VEGF、和(c)谷氨酰胺；其中所述量导致CD90、CD73和CD44在至少80％的所获得的心脏基质细胞群中表达；和ii.通过在无血清基础培养基中在存在至少一种第三细胞外基质蛋白的情况下培养步骤(i)的所述心脏基质细胞群扩增所述心脏基质细胞的数量，所述无血清基础培养基包含有效量的(a)FGF2、(b)VEGF和(c)谷氨酰胺，其中所述量导致CD90、CD73和CD44在至少80％的由步骤(ii)获得的心脏基质细胞群中保持表达。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(i)a1)中的所述无血清基础培养基包含最终浓度为10
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200ng/ml的FGF2，优选15
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100ng/ml，更优选20
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80ng/ml，甚至更优选30
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70ng/ml，最优选40
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60ng/ml，并且最优选约50ng/ml；其中步骤(i)a1)中的所述无血清基础培养基包含最终浓度为5
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100ng/ml的VEGF，优选7
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50ng/ml，更优选10
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40ng/ml，甚至更优选15
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35ng/ml，最优选20
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30ng/ml，并且最优选约25ng/ml的VEGF；其中步骤(i)a1)中的所述无血清基础培养基包含最终浓度为0.2
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20mM的谷氨酰胺，优
选0.5
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10mM的谷氨酰胺，更优选0.75
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5mM的谷氨酰胺，更优选1
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3mM的谷氨酰胺、更优选1.5
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2.5mM的谷氨酰胺，甚至更优选约2mM的谷氨酰胺，且最优选其中所述谷氨酰胺以L
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丙氨酸
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L
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谷氨酰胺二肽的形式存在；和/或其中步骤(i)a1)中的所述基础培养基包含最终浓度为0.1
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10μM的CHIR99021，优选0.2
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9μM，更优选0.3
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8μM，甚至更优选0.4
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7μM，仍更优选0.5
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6μM，更优选0.6
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5μM，更优选0.7
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4μM，更优选0.8
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3μM，最优选0.9
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2μM，且甚至最优选约1μM的CHIR99021。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(i)a2)中的所述无血清基础培养基包含最终浓度为10
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200ng/ml的FGF2，优选15
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100ng/ml，更优选20
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80ng/ml，甚至更优选30
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70ng/ml，最优选40
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60ng/ml，并且最优选约50ng/ml；其中步骤(i)a2)中的所述无血清基础培养基包含最终浓度为5
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100ng/ml的VEGF，优选7
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50ng/ml，更优选10
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40ng/ml，甚至更优选15
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35ng/ml，最优选20
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30ng/ml，并且最优选约25ng/ml的VEGF；和/或其中步骤(i)a2)中的所述无血清基础培养基包含最终浓度为0.2
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20mM的谷氨酰胺，优选0.5
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10mM的谷氨酰胺，更优选0.75
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5mM的谷氨酰胺，更优选1
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3mM的谷氨酰胺、更优选1.5
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2.5mM的谷氨酰胺，甚至更优选约2mM的谷氨酰胺，且最优选其中所述谷氨酰胺以L
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丙氨酸
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L
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谷氨酰胺二肽的形式存在。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(ii)中的所述无血清基础培养基包含最终浓度为10
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200ng/ml的FGF2，优选15
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100ng/ml，更优选20
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80ng/ml，甚至更优选30
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70ng/ml，最优选40
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60ng/ml，并且最优选约50ng/ml；其中步骤(ii)中的所述无血清基础培养基包含最终浓度为5
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100ng/ml的VEGF，优选7
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【专利技术属性】
技术研发人员：WH，
申请(专利权)人：乔治奥古斯特哥廷根大学公法大学医学基金会，
类型：发明
国别省市：