一种促进软骨细胞生长的方法技术

本发明专利技术公开一种促进软骨细胞生长的方法，包括以下步骤：(1)构建BMP

【技术实现步骤摘要】
一种促进软骨细胞生长的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及一种促进软骨细胞生长的方法。

技术介绍

[0002]软骨损伤是目前常见的疾病，关节软骨受破坏是骨关节病的主要病理改变，外伤等原因导致的软骨损伤最终也会导致骨关节病。因此，软骨修复成为骨科的重要问题之一。软骨损伤后虽然可以自我修复，但过程漫长，结果也很不理想。之所以软骨不易修复，第一个原因是软骨的代谢活跃,但没有血管的供应，所以修复能力有限；第二个原因是在损伤部位缺乏未分化的细胞,软骨细胞是一个高分化的细胞,损伤之后不能迁移生长到损伤的软骨之中；第三个原因是随着年龄的增长,软骨细胞的分裂能力会下降,同时产生细胞基质的能力也也会下降。
[0003]应用细胞及组织工程的方法进行软骨的修复是目前科学家正在努力研究的一个方向。人为干预软骨修复的主要方法包括：(1)在软骨下骨钻孔修复软骨损伤，(2)软骨移植，(3)骨膜及软骨膜移植，(4)软骨细胞移植，(5)未分化的MSC移植等。用移植修法复软骨的研究不少，希望很大；但影响因素也很多，主要包括：(1)需要足够量的修复细胞，通常采用106个/ml数量级，根据损伤大小使用0.1毫升至数毫升不等；(2)需要合适的载体，理想的载体应具备组织相容性，可吸收性，易于重复操作性，与移植的细胞亲合性。目前的载体有人工合成材料，如多聚乳酸(PLA)和多聚羟基乙酸(GPA)；生物成分，如II型胶原。
[0004]MSC移植治疗软骨损伤及关节炎的研究较多，普遍认为有效。但MSC的作用主要是其旁分泌功能，促进了胶原及糖胺多糖合成，从而缓解了症状，其实软骨的修复并不明显。包括MSC在内，至今还没有任何可以显著促进软骨修复的方法。
[0005]人骨形态发生蛋白
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2(BMP
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2)简介。骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)又称骨形成蛋白，是一组具有类似结构的高度保守的功能蛋白，属于TGF
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β家族。BMP能刺激DNA的合成和细胞的复制，从而促进MSC定向分化为成骨细胞。它还是体内诱导骨和软骨形成的主要因子，并在肢体生长、软骨内骨化、骨折早期、软骨修复时表达，对骨骼的胚胎发育和再生修复起重要作用。如今BMP家族已有43个成员，广泛地存在于猪、牛、羊、兔、鼠及人的胚胎、血细胞、肾和脾脏等组织中，且在不同种属间有较高的同源性。BMP不仅参与骨骼的调节，而且对脂肪、肾脏、肝脏、骨骼及神经系统发育也起到一定作用。
[0006]BMP分泌后既能与细胞外基质及可溶性拮抗剂结合，还能与多种细胞膜表面的蛋白受体相互作用。它不仅具有与其他骨生长因子不同的独特结构和理化性质，而且其家族中不同成员的基因定位及成骨机制等也不尽相同。BMP主要通过依赖Smad途径和p38
‑
MAPK途径两条信号通路发挥作用，且信号转导过程受细胞外拮抗剂、膜受体、细胞质微环境和转录水平4个层次的调节控制。在治疗上，BMP不仅能单独介导成骨作用，而且还能与其他骨生长因子联合，从而有加速疾病恢复的疗效。
[0007]BMP
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2在体内以前体形式合成，经蛋白酶切去除信号肽和前肽，得到由114个氨基酸残基组成的成熟肽。成熟肽通过7对二硫键将其保守结构正确折叠；成熟肽同源或异源二
聚体才具有生物活性；因此，制备基因重组BMP
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2蛋白质具有一定的难度。BMP的另外一个共同缺陷是其半衰期短，在体内易降解；因此多采取缓释技术局部用药，延缓其降解。所以，即使人们知道BMP应该会有促进软骨细胞生长的用处，但至今还没有开发出可用的产品。

技术实现思路

[0008]本专利技术的主要目的是提供一种促进软骨细胞生长的方法。在研究MSC及BMP
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2这两个目前对软骨生长最有希望的新手段的基础上，我们发现其二者都有优势，但同时都有严重的缺陷。曾经尝试过把二者联合应用，结果虽有改善但并不显著；主要问题前面已经有介绍，一方面是BMP
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2的二硫键多，真核表达不但量低而且后续纯化工艺复杂，原核表达时很难复性；另一方面是其半衰期太短，不能充分发挥作用。本专利技术在联合使用MSC及BMP
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2的过程中，寻找解决其两个主要问题的方案。突破点不是使用传统的真核或原核表达后纯化复性，然后再采用缓释技术延长其半衰期，而是通过基因重组技术把BMP
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2基因克隆到MSC细胞上，制备出了全新的BMP
‑
2基因重组MSC(MSCdBMP2)细胞。
[0009]为实现上述目的，本专利技术提出的一种促进软骨细胞生长的方法，包括以下步骤：
[0010]S101：制备hUC
‑
MSC细胞；
[0011]S102：把BMP
‑
2的编码基因克隆到一个带有跨膜区结构的真核表达载体pDisplay上，形成BMP
‑
2细胞膜表面展示质粒pdBMP2；
[0012]S103：把pdBMP2转染进MSC细胞，产生MSCdBMP2细胞；MSCdBMP2细胞可以直接应用，也可以用于制备MSCdBMP2Exo；
[0013]S104：用MSCdBMP2细胞和MSCdBMP2Exo刺激并促进软骨细胞生长。
[0014]优选地，在所述的S102中，BMP
‑
2蛋白质由396个氨基酸组成，其氨基酸序列为：
[0015]"MVAGTRCLLALLLPQVLLGGAAGLVPELGRRKFAAASSGRPSSQPSDEVLSEFELRLL
[0016]SMFGLKQRPTPSRDAVVPPYMLDLYRRHSGQPGSPAPDHRLERAASRANTVRSFHHEES
[0017]LEELPETSGKTTRRFFFNLSSIPTEEFITSAELQVFREQMQDALGNNSSFHHRINIYEI
[0018]IKPATANSKFPVTRLLDTRLVNQNASRWESFDVTPAVMRWTAQGHANHGFVVEVAHLEE
[0019]KQGVSKRHVRISRSLHQDEHSWSQIRPLLVTFGHDGKGHPLHKREKRQAKHKQRKRLKS
[0020]SCKRHPLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGECPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVN
[0021]SKIPKACCVPTELSAISMLYLDENEKVVLKNYQDMVVEGCGCR"
[0022]优选地，在所述的S102中，BMP
‑
2蛋白的基因DNA由1191个碱基组成，其编码序列为自5
’
端第1至第1191位碱基，其核苷酸序列为：
[0023]atggtggccgggacccgctgtcttctagcgttgctgcttccccaggtcctcctgggcggcgcggctg
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种促进软骨细胞生长的方法，其特征在于，包括以下步骤：S101：制备hUC
‑
MSC细胞；S102：把BMP
‑
2的编码基因克隆到一个带有跨膜区结构的真核表达载体pDisplay中，形成BMP
‑
2细胞膜表面展示质粒pdBMP2；S103：把pdBMP2转染进MSC细胞，产生MSCdBMP2细胞；S104：用MSCBdMP2细胞制备MSCdBMP2外泌体(MSCdBMP2Exo)；S105：用MSCdBMP2细胞和MSCdBMP2Exo刺激并促进软骨细胞生长。2.根据权利要求1所述的一种促进软骨细胞生长的方法，其特征在于，在所述的S102中，BMP
‑
2蛋白质由396个氨基酸组成，其氨基酸序列为：MVAGTRCLLALLLPQVLLGGAAGLVPELGRRKFAAASSGRPSSQPSDEVLSEFELRLLSMFGLKQRPTPSRDAVVPPYMLDLYRRHSGQPGSPAPDHRLERAASRANTVRSFHHEESLEELPETSGKTTRRFFFNLSSIPTEEFITSAELQVFREQMQDALGNNSSFHHRINIYEIIKPATANSKFPVTRLLDTRLVNQNASRWESFDVTPAVMRWTAQGHANHGFVVEVAHLEEKQGVSKRHVRISRSLHQDEHSWSQIRPLLVTFGHDGKGHPLHKREKRQAKHKQRKRLKSSCKRHPLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGECPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVNSKIPKACCVPTELSAISMLYLDENEKVVLKNYQDMVVEGCGCR。3.根据权利要求1所述的一种促进软骨细胞生长的方法，其特征在于，在所述的S102中，BMP
‑
2蛋白的基因(DNA)由1191个碱基组成，其编码序列为自5
’
端第1至第1191位碱基，其核苷酸序列为：atggtggccgggacccgctgtcttctagcgttgctgcttccccaggtcctcctgggcggcgcggctggcctcgttccggagctgggccgcaggaagttcgcggcggcgtcgtcgggccgcccctcatcccagccctctgacgaggtcctgagcgagttcgagttgcggctgctcagcatgttcggcctgaaacagagacccacccccagcagggacgccgtggtgcccccctacatgctagacctgtatcgcaggcactcaggtcagccgggctcacccgccccagaccaccggttggagagg...

【专利技术属性】
技术研发人员：张明杰，马云坤，
申请(专利权)人：深圳市汉科生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：