一种诱导人多能干细胞向成熟心肌细胞的分化方法技术

本发明专利技术公开了一种诱导人多能干细胞向成熟心肌细胞的分化方法，具体为第

【技术实现步骤摘要】
一种诱导人多能干细胞向成熟心肌细胞的分化方法


[0001]本专利技术涉及干细胞分化领域，具体地说是一种诱导人多能干细胞向成熟心肌细胞的分化方法。

技术介绍

[0002]人类多能干细胞(hPSC)，包括胚胎干细胞(ESCs)和诱导多能干细胞(iPSCs)，已经成功的实现在体外向心肌细胞(CMs)的分化。干细胞分化而来的心肌细胞具有广泛的应用前景，常用于心脏疾病相关的再生治疗、遗传性心脏病机制的探究、新型药物发现以及药物心脏毒理安全性评价等方面。
[0003]如中国专利CN108265029A公布了一种人类多能干细胞来源的人类心室肌细胞的筛选及制备方法，其利用基因组编辑技术，构建MYL2基因结尾携带新霉素或绿色荧光蛋白筛选基因的人类多能干细胞细胞系，并定向诱导分化为心肌细胞，进而通过新霉素或绿色荧光蛋白筛选基因纯化得到人类心室肌细胞，其可与任意支架材料结合培养形成性质不同的各种工程化人类心室肌组织。本制备的人类心室肌细胞具备与正常人类心室肌细胞相似的表型及电生理反应，来源广泛，且能长期体外培养。为针对心室肌损伤与疾病的治疗手段和筛选有效的药物提供了良好的平台。再如中国专利CN105039399A公布了人类多能干细胞
‑
遗传性心肌病心肌细胞及其制备技术，其利用TALEN或CRISPR/CAS9基因组编辑技术，构建人类遗传性心肌病多能干细胞，制得的人类遗传性心肌病变心肌细胞，可以与任意支架材料结合培养形成的各类体外人类遗传性心肌病疾病心肌组织。
[0004]但是目前传统的2D分化方法分化而来的心肌细胞虽然具有和心肌细胞类似的分子、结构以及功能特性，但仍处于尚不成熟的胎儿阶段，在心肌细胞形态以及功能上与成人CMs有十分明显的差异，这样的差异严重限制了hPSC
‑
CMs的应用。
[0005]为了解决这一关键问题，研究者们提出了多种方法来促进hPSC
‑
CMs的成熟。例如，在2D培养水平上，科学家发现在培养基中额外添加T3以及RA均有明显的促成熟作用，另外Dongjian等人也发现将含糖培养基换成无糖培养基，并添加脂肪酸作为主要能量来源，可以使hPSC
‑
CMs的代谢方式由有氧糖酵解转变为氧化磷酸化，从而提高了细胞线粒体含量、功能基因表达、肌节长度和收缩性。之后也有许多研究者模仿心肌细胞在体内的自然环境，模拟不同的3D条件促进其成熟。例如Kadota等人发现移植到大鼠心脏中的hPSC
‑
CMs的成熟程度有所改善。也有通过纤维蛋白水凝胶包裹hPSC
‑
CMs形成3D结构，利用模具对其进行拉伸和辅助收缩，同时给予一定规律的电刺激，hPSC
‑
CMs表现出更接近成人心肌的基因表达谱、肌节结构、代谢方式等特性。
[0006]而传统的3D组织工程或加以电刺激和机械刺激的做法操作复杂，不利于进行后续大规模的实验操作；若能在2D水平上直接通过优化培养基的添加物的方法促进其成熟，即可实现批量化生产心肌细胞的目的。因此，急需设计一种新的诱导人多能干细胞向成熟心肌细胞的分化方法，以求在2D水平上直接通过优化培养基的添加物的方法促进其成熟。

技术实现思路

[0007]现有诱导人多能干细胞向成熟心肌细胞的分化方法中，传统的3D组织工程或加以电刺激和机械刺激的做法操作复杂，不利于进行后续大规模的实验操作，本专利技术设计了一种诱导人多能干细胞向成熟心肌细胞的分化方法，以求直接通过在心肌细胞培养基的添加细胞因子IGF
‑
2的方法来达到获取更加成熟的心肌细胞。
[0008]一种诱导人多能干细胞向成熟心肌细胞的分化方法，包括以下步骤：
[0009]分化前IPS准备阶段步骤：
[0010]步骤S1、待hiPSCs长至约95％融合时，用DPBS洗涤细胞，然后加入1mL versene消化后，吸去versene，用1mL含有10μM Y
‑
27632的mTeSR1将细胞吹打成单细胞，按2
×
105个/孔的密度种12孔板中；
[0011]步骤S2、第二天更换新鲜的mTeSR1培养基，每孔1毫升，每24小时更换一次新鲜培养基；
[0012]步骤S3、待细胞长至约95％汇合时，将培养基换为心肌细胞分化培养基进行诱导；
[0013]心肌分化步骤：
[0014]步骤S4、第0
‑
2天，在心肌分化培养基中加入CHIR99021，每孔2毫升；
[0015]步骤S5、第2
‑
3天，更换新鲜的心肌分化培养基，每孔1毫升；
[0016]步骤S6、第3
‑
7天，在心肌分化培养基中培养基中加入IWR
‑
1,每孔2毫升，每48小时换液一次；
[0017]步骤S7、第7天时，换成新鲜的心肌分化培养基培养基，此后每两天换一次液；
[0018]步骤S8、第15天时，弃去培养基，每孔加入trypleExpress，消化30min后；用移液枪吹打细胞，收集细胞悬液；再用尼龙滤网过滤细胞悬液，离心；用心肌细胞维持培养基重悬细胞沉淀，以4
×
105个/孔的密度种于matrigel包被的12孔板中进行培养；每两天换液一次，每孔1毫升；
[0019]步骤S9、在第19
‑
27天，在心肌细胞维持培养基中加入IGF
‑
2，并每两天换一次液，每孔1毫升。
[0020]优选地，所述步骤S2中、用新鲜的mTeSR1中不含有Y
‑
27632。
[0021]优选地，所述步骤S4中，加入的CHIR99021为0.5
‑
10μM。
[0022]优选地，所述步骤S6中，加入的IWR
‑
1为0.5
‑
20μM。
[0023]优选地，所述步骤S8中，trypleExpress的加入量为500μL，消化温度为37℃。
[0024]优选地，所述步骤S9中，在维持培养基中加入的IGF
‑
2为0.1
‑
1μg/mL。
[0025]优选地，所述步骤S8中，尼龙滤网的孔径为70微米。
[0026]优选地，心肌分化培养基为1640、2％B27 minus insulin。
[0027]优选地，心肌维持培养基为1640、2％B27。
[0028]本申请的优点和效果如下：
[0029]1、本申请设计的一种诱导人多能干细胞向成熟心肌细胞的分化方法，其第
‑
2天至第0天为hiPSCs培养阶段，用所用培液为mTeSR；第0
‑
15天为心肌细胞诱导阶段，所用培液为添加不含insulin的B27的PRMI1640，分别用GSK3抑制剂CHIR99021和Wnt抑制剂IWR
‑
1诱导细胞；第15
‑
30天为心本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种诱导人多能干细胞向成熟心肌细胞的分化方法，其特征在于，包括以下步骤：分化前IPS准备阶段步骤：步骤S1、待hiPSCs长至约95％融合时，用DPBS洗涤细胞，然后加入1mL versene消化后，吸去versene，用1mL含有10μMY
‑
27632的mTeSR1将细胞吹打成单细胞，按2
×
105个/孔的密度种12孔板中；步骤S2、第二天更换新鲜的mTeSR1培养基，每孔1毫升，每24小时更换一次新鲜培养基；步骤S3、待细胞长至约95％汇合时，将培养基换为心肌细胞分化培养基进行诱导；心肌分化步骤：步骤S4、第0
‑
2天，在心肌分化培养基中加入CHIR99021，每孔2毫升；步骤S5、第2
‑
3天，更换新鲜的心肌分化培养基，每孔1毫升；步骤S6、第3
‑
7天，在心肌分化培养基中培养基中加入IWR
‑
1,每孔2毫升，每48小时换液一次；步骤S7、第7天时，换成新鲜的心肌分化培养基，此后每两天换一次液；步骤S8、第15天时，弃去培养基，每孔加入ttrypleExpress，消化30min后；用移液枪吹打细胞，收集细胞悬液；再用尼龙滤网过滤细胞悬液，离心；用心肌细胞维持培养基重悬细胞沉淀，以4
×
105个/孔的密度种于matrigel包被的12孔板中进行培养；每两天换液一次，每孔1毫升；步骤S9、在第19
‑
27天，在心肌细胞维持培养基中加入I...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈宇，
申请(专利权)人：陈宇，
类型：发明
国别省市：