多层工程化心肌制造技术

本申请描述了用于制造多层工程化心肌的方法。具体地，该方法涉及(

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】多层工程化心肌
本专利技术的背景
[0001]让衰竭的心脏再生仍然是一个巨大的挑战。心力衰竭的常见原因是心脏病发作(heart attack)。心脏病发作或心肌梗死(myocardial infarction)是由动脉血流受阻引起的，导致组织灌注不足，从而被剥夺了氧气和营养。在心脏病发作期间，数以百万计甚至多达十亿计的细胞迅速坏死，这是导致心脏性能下降的主要原因，在临床上称为心力衰竭。由于心脏主要是有丝分裂后组织(post
‑
mitotic tissue)，因此心脏组织不能自行再生。植入工程化心肌是该领域追求的目标。已经开发了不同的工程化心肌形式(engineered heart muscle formats)，用于疾病建模、药物筛选和心脏修复。本专利技术人和其他人已经发表了工程化人心肌模型用于心肌细胞成熟和肥大的体外研究(Tiburcy等人，2017)、疾病建模(Hanses等人，2020)和药物筛选(Mills等人，2019)以及体内心脏修复(Riegler等人，2015)的若干应用。
[0002]支持心肌细胞自组装为3D组织的一种方法是含支架的方法，其中支架主要由胶原或纤维蛋白支撑(Zimmermann等人2006，Tulloch等人2011，Soong等人2012，Zhang等人2013，Riegler等人2015，Weinberger等人2016，Tiburcy等人2017)。此外，非肌细胞(non
‑
myocytes)对于三维组织的生成至关重要。与啮齿动物模型相似(Naito等人，2006)，所述非肌细胞主要是成纤维细胞或具有成纤维细胞活性的基质细胞(Kensah等人，2013；Ronaldson
‑
Bouchard等人；2018；Tiburcy等2017，Zhang等人，2013)。
[0003]除了细胞成分和支架之外，在生物物理刺激即机械刺激、电刺激或两者的结合的支持下，已经实现了最高程度的成熟(Ronaldson
‑
Bouchard等人，2018；Tiburcy等人，2017)。对于高度成熟的心肌的工程化而言，机械负荷(mechanical loading)是绝对的要求。
[0004]为了生产用于治疗心肌无力患者的人工心肌组织，工程化心肌需要支持人类心脏跳动的力量。患者中待治疗的心壁厚度通常为5
‑
10mm(Kawel等人，2012)，即植入物必须理想地达到该厚度，并且还必须能够产生机械力以支持心壁功能。
[0005]当试图获得如此厚度的工程化心肌时，一个关键的挑战是嵌入工程化心肌中的细胞在任何时候都能得到氧气和营养供应。因此，在本领域中需要具有足够厚度的工程化心肌以支持人类心脏。本专利技术人已经通过工程化心肌的重复且依次进行的浇注工艺(repetitive and sequential casting process)克服了这一挑战。

技术实现思路

[0006]为了产生多层工程化心肌(multilayer engineered heart muscle，MEHM)，含细胞的水凝胶的致密化的层(重构混合物(reconstitution mixture))被至少一个其他层包覆。这种重复且依次进行的工艺确保了增厚和强化的工程化心肌的形成，其中至少一个新层与先前的层合并。换句话说，通过重复且依次进行的成层(layering)，工程化心肌的厚度得以增加。此外，重要的是工程化的心肌被机械支撑物穿透(penetrated)，其中杆状物(pole)延伸穿过工程化的组织，以便支持增张力性收缩(auxotonic contraction)并在整
heart pouch)或工程化心脏圆柱体(engineered heart cylinder)，其中EHM包括(a)胶原，(b)心肌细胞和非肌细胞的细胞混合物，并且其中EHM的厚度为至少约0.6mm。
[0018]此外，本专利技术公开了通过本文所公开的方法获得的MEHM或如本文所公开的MEHM在体外制造工程化人类心肌中的用途。
[0019]最后，描述了通过本文所公开的方法获得的多层EHM或如本文所公开的MEHM用于医学，特别是心力衰竭的用途。
具体实施方式
[0020]在第一方面，公开了一种制造多层工程化心肌(MEHM)的方法，其中该方法包括以下步骤：(
ⅰ
)在模具中提供液体重构混合物，其中所述重构混合物被至少两个杆状物穿孔，其中所述重构混合物包含(a)胶原，(b)心肌细胞和非肌细胞的细胞混合物和(c)合适的重构介质，由此所述重构混合物在所述模具中发生胶凝，(
ⅱ
)将通过步骤(
ⅰ
)获得的在所述模具中的混合物在合适的培养培养基中进行培养，由此所述重构混合物在所述模具中致密化；(
ⅲ
)a)将另外的如步骤(
ⅰ
)中所限定的液体重构混合物从顶部和/或从底部加入到由步骤(
ⅱ
)获得的所述致密化的重构混合物中，由此所述另外的液体重构混合物发生胶凝，随后在与步骤(
ⅱ
)中相同的条件下进行培养，由此所述另外的重构混合物在模具中致密化；或b)将由步骤(
ⅱ
)获得的该致密化的重构混合物转移到不同的模具中，其中所述重构混合物被至少两个杆状物穿孔，随后在所述不同的模具中进行步骤(
ⅲ
)a)；从而获得多层工程化心肌(MEHM)，优选地，其中所述MEHM通过重复步骤(iii)a)和/或步骤(iii)b)至少一次而加厚，和(iv)任选地，将在所述模具中的步骤(
ⅲ
)的MEHM在合适的成熟化培养基中进行培养，其中所述MEHM能够收缩。
[0021]一般而言，本文所用的工程化心肌(EHM)是指包含细胞和胶原的人工心肌，其能够收缩(contracting)。此外，多层工程化心肌(MEHM)源自至少2层工程化心肌(EHM)。为了制造多层工程化心肌(MEHM)，依次添加各层。当发生依次进行的成层(sequential layering)时，后续层会添加到原始(第一)层上。随后，后续层会与原始(第一)层合并。这种成层过程可能会重复几次。换句话说，随后的一层会与之前添加的一层合并。进行成层时，MEHM会逐层增厚。这种方法的主要优点是加厚的MEHM比单层EHM更稳定，能够承受更大的力。此外，MEHM的另一个关键特征是其能够收缩，类似于天然心脏心肌，优选如下文所进一步限定的。理想情况下，这种多层工程化心肌适合用作植入物，例如心脏植入物。
[0022]在一个实施方案中，通过步骤(
ⅲ
)和任选的步骤(iv)获得的MEHM具有收缩能力，这可以通过目视检查来评估。或者，MEHM的收缩可以通过步骤(
ⅰ
)的重构混合物通过进行步骤(
ⅰ
)、(
ⅱ
)和任选的(iv)来形成产生力的工程化心肌(EHM)的能力来确定，并且其中工程化心肌(EHM)能够产生为至少0.05mN收本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种制造多层工程化心肌(MEHM)的方法，所述方法包括以下步骤：(
ⅰ
)在模具中提供液体重构混合物，其中所述重构混合物被至少两个杆状物穿孔，其中所述重构混合物包含(a)胶原，(b)心肌细胞和非肌细胞的细胞混合物和(c)合适的重构介质，由此所述重构混合物在所述模具中发生胶凝，(
ⅱ
)将通过步骤(
ⅰ
)获得的在所述模具中的所述混合物在合适的培养培养基中进行培养，由此所述重构混合物在所述模具中致密化；(
ⅲ
)a)将另外的如步骤(
ⅰ
)中所限定的液体重构混合物从顶部和/或从底部加入到由步骤(
ⅱ
)获得的所述致密化的重构混合物中，由此所述另外的液体重构混合物发生胶凝，随后在与步骤(
ⅱ
)中相同的条件下进行培养，由此所述另外的重构混合物在所述模具中致密化；或b)将由步骤(
ⅱ
)获得的所述致密化的重构混合物转移到不同的模具中，其中所述重构混合物被至少两个杆状物穿孔，随后在所述不同的模具中进行步骤(
ⅲ
)a)；从而获得多层工程化心肌(MEHM)，优选地，其中所述MEHM通过重复步骤(iii)a)和/或步骤(iii)b)至少一次而加厚，和(iv)任选地，将在所述模具中的步骤(
ⅲ
)的MEHM在合适的成熟化培养基中进行培养，其中所述MEHM能够收缩。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述MEHM收缩的能力是通过目视检查和/或通过确定步骤(
ⅰ
)的所述重构混合物通过进行步骤(
ⅰ
)、(
ⅱ
)和任选的(
ⅳ
)来形成产生力的工程化心肌的能力来评估的，并且其中所述工程化心肌能够产生为至少0.05mN收缩力(FOC)的收缩力，如在Tiburcy等人的Circulation 135(19)1832
‑
1847(2017)的附加图6C中的标准等距条件下测得的。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述收缩是通过使用在Tiburcy等人的Circulation 135(19)1832
‑
1847(2017)中描述的方法的MEHM的面积变化分数(FAC)测量来确定的，并且其中所述面积变化分数(FAC)在电刺激时为至少0.5％，优选地，其中所述FAC为至少0.7％，更优选至少1％，更优选至少2％，更优选至少3％，还更优选至少5％。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述非肌细胞选自以下一种或多种：基质细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和间充质干细胞，优选地，其中所述非肌细胞为基质细胞或内皮细胞，更优选地，其中所述非肌细胞为基质细胞，还更优选地，其中所述基质细胞为心脏基质细胞，还更优选地，其中所述心脏基质细胞具有成纤维细胞特性，还更优选地，其中所述心脏基质细胞为成纤维细胞。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述MEHM为补片、袋或圆柱体的形式。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(
ⅰ
)中所述的胶凝的特征在于所述重构混合物是不透明的，优选如Tiburcy M等人的Collagen
‑
based engineered heart muscle,Methods Mol Biol.2014；1181:167
‑
76的图3B中所示出的，通过目视检查确定。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述步骤(
ⅱ
)的完成通过以下步骤确定：(a)通过进行步骤(
ⅰ
)和(
ⅱ
)产生与所述MEHM平行的环形形式的工程化心肌(EHM)，以及(b)确定所述呈环形形式的工程化心肌(EHM)从所述模具中脱离，如在Tiburcy M等人的Collagen
‑
based engineer...

【专利技术属性】
技术研发人员：W，
申请(专利权)人：乔治奥古斯特哥廷根大学公法大学医学基金会，
类型：发明
国别省市：