一种表达PD-L1抗体的细胞囊泡及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，具体涉及一种表达PD

【技术实现步骤摘要】
一种表达PD
‑
L1抗体的细胞囊泡及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种表达PD
‑
L1抗体的细胞囊泡及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]CAR
‑
T细胞疗法是指通过基因工程技术将编码特异性抗原识别结构域和T细胞激活信号的遗传物质转入T细胞，从而使其转化为可靶向高效杀伤肿瘤细胞的CAR
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T细胞。目前，CAR
‑
T细胞已在血液肿瘤治疗中取得了巨大的成功，为人类的抗癌战争带来了胜利的曙光。然而，其在实体瘤治疗领域的前景尚不明朗，一个重要的原因是实体瘤的肿瘤免疫微环境(TME)对CAR
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T细胞具有明显的抑制作用。CAR
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T细胞的作用常常会导致肿瘤细胞上调表面PD
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L1的表达，而免疫检查点PD
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L1的存在，常常会抑制CAR
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T细胞的增殖与杀伤能力。鉴于谷氨酰胺在促进肿瘤疯狂生长所需的代谢中发挥的关键作用，通过抑制谷氨酰胺代谢，不仅能够抑制肿瘤生长并改变肿瘤微环境，而且还能改善CAR
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T细胞免疫疗法的疗效，但是其同时具有全身性的毒副反应，而且谷氨酰胺拮抗剂使用时会导致肿瘤细胞表面PD
‑
L1表达上调，可能存在使CAR
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T细胞发生过早衰竭的问题。
[0003]细胞膜来源的纳米囊泡由于具有良好的生物相容性、易修饰性和跨越生物屏障的能力，已成为极具吸引力的药物递送载体。特别是基因工程细胞膜，其能够继承原有细胞膜的成分和功能，一方面作为具有生物活性的药物载体，负载化疗或免疫治疗药物进行靶向治疗，提高局部药物浓度的同时减少全身的毒副作用。另一方面其能够展示全长的抗体、受体或配体，并保持其天然的结构和功能，在实现靶向递送的同时发挥其抗体或配体的生物学功能。

技术实现思路

[0004]针对目前现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种表达PD
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L1抗体的细胞囊泡及其制备方法和应用。将PD
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L1抗体的单链可变片段表达在细胞膜上，然后通过直接收集或挤取含有表达PD
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L1抗体的细胞囊泡，将谷氨酰胺拮抗剂加载到细胞囊泡中，用于增强CAR
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T细胞对于实体瘤的疗效。由于anti
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PD
‑
L1囊泡对过表达PD
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L1的肿瘤具有良好的靶向性，因此能够作为载体将谷氨酰胺拮抗剂靶向递送到肿瘤微环境中，减少药物的毒副作用。此外，由于anti
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PD
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L1能够通过与肿瘤细胞表面的PD
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L1结合阻断PD
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1/PD
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L1的免疫抑制信号轴，因此有望解决谷氨酰胺拮抗剂使用时导致的肿瘤细胞表面PD
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L1表达上调，从而使CAR
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T细胞发生过早衰竭的问题。
[0005]本专利技术的首要目的在于提供一种表达PD
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L1抗体的细胞囊泡，由生物细胞膜构成，细胞膜表面表达PD
‑
L1抗体的单链可变片段，内部负载有谷氨酰胺拮抗剂。
[0006]优选地，所述细胞膜来源包括但不限于HEK293T细胞、肿瘤细胞，免疫细胞等，对肿瘤细胞所表达的PD
‑
L1具有良好的靶向性，而且具有运载药物的功能。
[0007]优选地，所述谷氨酰胺拮抗剂与细胞囊泡的质量体积比为2：8
‑
1：1(μg/μL)。
[0008]优选地，所述谷氨酰胺拮抗剂包括但不限于BPTEs，AG
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221，CB
‑
839，AZD3965，TVB
‑
2640。
[0009]优选地，所述细胞囊泡的平均粒径为80
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120nm。
[0010]本专利技术的另一目的在于提供一种所述表达PD
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L1抗体的细胞囊泡的制备方法。
[0011]本专利技术通过以下技术方案实现上述目的：
[0012]一种表达PD
‑
L1抗体的细胞囊泡的制备方法，包括以下步骤：
[0013]S1、将能够表达针对PD
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L1的单链可变片段的核苷酸序列克隆至含有CD19
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CAR的pCDH
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CMV
‑
MCS
‑
EF1
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copGFP的质粒中，替换掉CD19 CAR中的抗CD19 scFv，获得含有针对PD
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L1的单链可变片段基因序列的质粒；
[0014]S2、将步骤S1所得质粒进行慢病毒包装，将慢病毒感染靶细胞，建立稳定表达含有针对PD
‑
L1的单链可变片段的稳转细胞系；
[0015]S3、收集步骤S2所得稳转细胞系的细胞膜进行裂解、梯度离心，沉淀重悬后经挤压获得细胞囊泡；
[0016]S4、将谷氨酰胺拮抗剂负载到步骤S3所得细胞囊泡中，得到表达嵌合抗原受体的细胞囊泡。
[0017]优选地，T细胞表面表达嵌合抗原受体，其中的抗原包括肿瘤特异性抗原或者肿瘤相关抗原包括但不限于Mesothelin，CEA，EGFR，HER2，PMSA，GPC3，GD2等。
[0018]优选地，步骤S4所述负载谷氨酰胺拮抗剂时采用电穿孔的方式。
[0019]专利技术人通过将针对对人及鼠PD
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L1都有者良好的亲和力的单克隆抗体序列表达在细胞上，然后再挤取或分离表达PD
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L1的单克隆抗体序列的细胞囊泡，最后通过电转将谷氨酰胺拮抗剂等药物负载在该细胞囊泡中，一方面实现谷氨酰胺拮抗剂靶向递送的同时解决了其治疗过程中导致的PD
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L1上调问题，另一方面BPTEs@anti PD
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L1 NVs通过对肿瘤代谢微环境的重塑增强CAR
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T治疗实体瘤的效果。该方式提供了一套辅助CAR
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T治疗实体瘤的新体系平台，为增强CAR
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T治疗实体瘤提供新的选择手段。
[0020]本专利技术的第三个目的在于提供上述表达PD
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L1抗体的细胞囊泡在制备增强CAR
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T细胞抗实体肿瘤效果的药物中的应用。
[0021]优选地，所述实体肿瘤为肺癌。
[0022]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0023](1)本专利技术通过将针对PD
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L1抗原的单克隆抗体的scFv片段表达在细胞囊泡上，可起到免疫检查点阻断的作用，激活内源性T细胞及CAR
‑
T细胞。
[0024](2)本专利技术通过将谷氨酰胺拮抗剂加载在细胞囊泡中，可利用细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达PD
‑
L1抗体的细胞囊泡，其特征在于，由细胞膜表面能表达PD
‑
L1抗体的单链可变片段的生物细胞膜构成，细胞囊泡内部负载有谷氨酰胺拮抗剂。2.根据权利要求1所述的一种表达PD
‑
L1抗体的细胞囊泡，其特征在于，所述生物细胞膜来源包括HEK293T细胞，肿瘤细胞，免疫细胞。3.根据权利要求1所述的一种表达PD
‑
L1抗体的细胞囊泡，其特征在于，所述谷氨酰胺拮抗剂与细胞囊泡的质量体积比(μg/μL)为2：8
‑
1：1。4.根据权利要求1所述的一种表达PD
‑
L1抗体的细胞囊泡，其特征在于，所述谷氨酰胺拮抗剂包括BPTEs，AG
‑
221，CB
‑
839，AZD3965，TVB
‑
2640。5.根据权利要求1所述的一种表达PD
‑
L1抗体的细胞囊泡，其特征在于，所述细胞囊泡的平均粒径为80
‑
120nm。6.权利要求1
‑
5任一项所述的表达PD
‑
L1抗体的细胞囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将能够表达针对PD
‑
L1的单链可变片段的核苷酸序列克隆...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄曦，李咸君，
申请(专利权)人：中山大学附属第五医院，
类型：发明
国别省市：