单克隆抗体、其衍生物及它们的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种单克隆抗体、其衍生物及它们的应用，本发明专利技术分别利用两株杂交瘤制备得到两种ROR1单克隆抗体，通过对两个单克隆抗体进行测序，明确了两个单克隆抗体的CDR区和轻、重链的核苷酸与氨基酸序列。在对两种单抗的核苷酸序列转化载体后，表达得到的融合单抗，其对ROR1的识别性和吸附效果良好。对ROR1的识别性和吸附效果良好。对ROR1的识别性和吸附效果良好。

【技术实现步骤摘要】
单克隆抗体、其衍生物及它们的应用
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请与电子格式的序列表一同提交，所提供的序列表名称为“202112序列表.txt”，创建于2021年12月20日，其文件大小为24.0kb。该序列表的电子格式的信息通过引用其全文纳入本申请文件中。


[0003]本专利技术涉及能够识别受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)的单克隆抗体、其衍生物及它们的应用。

技术介绍

[0004]ROR1(Receptor
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tyrosine
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kinase
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like orphan receptor 1，类受体酪氨酸激酶孤儿受体1)的编码基因共2814bp，位于染色体1p31.3。ROR1膜蛋白由937个氨基酸组成，分子量约105kDa。ROR1结构在生物种间高度保守，如人与鼠的ROR1氨基酸序列同源性可达97％。如图1所示，人源ROR1由一个胞外的免疫球蛋白样结构域(Ig)、两个富含半胱氨酸的结构域(FZD)、近膜kringle结构域、单次跨膜结构以及一个胞内酪氨酸激酶结构域(TKD)、两个丝/苏氨酸富集结构域(S/TRD)和一个脯氨酸富集结构域(PRD)组成(Nicholas Borcherding，David Kusner，Guang
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Hui Liu，et al.ROR1，an embryonic protein with an emerging role in cancer biology[J].Protein Cell.2014，5(7):496
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502.)。
[0005]免疫球蛋白样结构域(Ig)和半胱氨酸富集结构域(FZD)与ROR1结合配体的功能相关。其中FZD结构域由10个保守的半胱氨酸残基和5个相应的二硫键组成。FZD结构还见于平滑肌家族受体(如Smo)、卷曲家族受体(如sFRP)、金属羧肽酶Z(CPZ)、collagenα1XVIII和低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)。这些蛋白大都可以结合Wnt蛋白并参与Wnt通路的信号转导。目前大量研究己经证实ROR1也是通过FZD结合Wnt5a并激活非经典Wnt信号通路。Kringle结构域在ROR家族中比较保守，由80个氨基酸组成，其结构特点是含有三个由二硫键形成的环状结构，这三个环状结构也参与了ROR受体识别Wnt蛋白的过程。
[0006]许多研究表明，ROR1在恶性细胞中高水平表达。ROR1首先在在血液系统恶性肿瘤中被确定为癌胚基因。2001年，两研究团队通过cDNA芯片观察到与正常B淋巴细胞相比，慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞中ROR1的转录水平较高(Hudecek M，Schmitt TM，Baskar S，Lupo
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Stanghellini MT，Nishida T，Yamamoto TN，et al.The B
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cell Tumor
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Associated Antigen ROR1 can be Targeted With T Cells Modified to Express a ROR1
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specific Chimeric Antigen Receptor.Blood(2010)116:4532
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41.)。然而，ROR1的重要性直到几年后才被认识。2008年，Fukuda等利用单克隆抗体(mAb)在蛋白水平鉴定CLL细胞中异常表达的ROR1。这项研究还确定了Wnt5a是ROR1的配体，它以ROR1依赖的方式刺激促生存信号的激活(Fukuda T，Chen L，Endo T，Tang L，Lu D，Castro JE，et al.Antisera Induced by Infusions of Autologous Ad
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CD154
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Leukemia B Cells Identify ROR1 as an Oncofetal Antigen and Receptor for Wnt5a.Proc Natl Acad Sci USA(2008)105:
3047
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52)。同时发现ROR1的表达对CLL患者的预后有显著影响。此外，发现ROR1在B急性淋巴细胞白血病(B
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ALL)的一个亚组中表达，主要在t(1；19)染色体易位的患者中表达。这些B
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ALL细胞对siRNA介导的ROR1沉默敏感，表明ROR1维持白血病细胞存活的关键功能(Bicocca VT，Chang BH，Masouleh BK，Muschen M，Loriaux MM，Druker BJ，et al.Crosstalk Between ROR1 and the Pre
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B Cell Receptor Promotes Survival of T(1；19)Acute Lymphoblastic Leukemia.Cancer Cell(2012)22:656
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67.)。ROR1在套细胞淋巴瘤(MCL)中也异常表达，触发与CLL和B
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ALL相似的促生存信号。研究发现，其他几种类型的非霍奇金淋巴瘤(NHL)，包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤和边缘区淋巴瘤表达ROR1，但其功能尚未明确表征。此外，在CD34+急性髓系白血病(AML)细胞中发现ROR1，可被mAb靶向作用(Balaian L，Sadarangani A，Widhopf GF II，Zhong R，Prussak C，Marra M，et al.A Highly Selective Anti
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ROR1 Monoclonal Antibody Inhibits Human Acute Myeloid Leukemia CD34+Cell Survival and Self
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Renewal.Blood(2012)120:2560.)。
[0007]此外，除了在血液恶性肿瘤中，还在广泛的实体瘤中发现ROR1的异常表达，因此，ROR1可作为生物标志物和治疗靶点。在乳腺癌中，发现ROR1在肿瘤标本中呈阳性而在正常乳腺组织中不呈阳性(Zhang S，Chen L，Cui B，Chuang HY，Yu J，Wang
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Rodriguez J，et al.ROR1 is Expressed in Human Breast Cancer and Associated With Enhanced Tumor
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Cell Growth.PloS One(2012)7:e31127.)。ROR1在乳腺癌中的高表达与上皮间质转化(EMT)、肿瘤转移和侵袭性疾病有关。ROR1在肺癌细胞中也有高水平的发现，作为肺腺癌患者的预后生物标志物。ROR1沉默导致代表人肺腺癌的细胞系生长抑制本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种单克隆抗体，其包含：(i)第一重链可变结构域，所述第一重链可变结构域包含如SEQ ID NO:1
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3所示的重链互补决定区VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，VHCDR1包含序列GFTFSSYA(SEQ ID NO:1)；VHCDR2包含序列INRGVTT(SEQ ID NO:2)；VHCDR3包含序列ARYDGNYEGMDY(SEQ ID NO:3)；(ii)第一轻链可变结构域，所述第一轻链可变结构域包含如SEQ ID NO:4
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6所示的轻链互补决定区VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，其中：VLCDR1包含序列QDINSY(SEQ ID NO:4)；VLCDR2包含序列RAN(SEQ ID NO:5)；VLCDR3包含序列LQYDEFPYT(SEQ ID NO:6)，其中，CDR是根据Kabat编号定义的。2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述第一重链可变结构域和第一轻链可变结构域分别包含如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所列的氨基酸序列。3.一种单克隆抗体，其包含：(i)第二重链可变结构域，所述重链可变结构域包含如SEQ ID NO:7
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9所示的重链互补决定区VHCDR4、VHCDR5和VHCDR6，其中：VHCDR4包含序列GYTFTECA(SEQ ID NO:7)；VHCDR5包含序列INPNNGGT(SEQ ID NO:8)；VHCDR6包含序列AREAIYYDYAMDY(SEQ ID NO:9)；(ii)第二轻链可变结构域，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：任宝永，刘鹏，
申请(专利权)人：思格苏州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：