一种海洋生物抗菌肽药物提取方法技术

本发明专利技术涉及抗菌肽提取技术领域，且公开了一种海洋生物抗菌肽药物提取方法，所述提取方法为：首先利用内切酶断裂黄鲫蛋白生成活性肽组份，然后设计合成磷脂功能化改性D101大孔吸附树脂Rpf，包括：磷脂功能化改性D101大孔吸附树脂Rpf

【技术实现步骤摘要】
一种海洋生物抗菌肽药物提取方法


[0001]本专利技术涉及抗菌肽提取
，具体为一种海洋生物抗菌肽药物提取方法。

技术介绍

[0002]抗菌肽是一类具有抗菌活性的小分子短肽，为宿主天然免疫防御系统的重要组成，具有分子量小、热稳定性高、抗菌谱较广等特点。食物蛋白可以通过反应条件温和、反应过程容易控制的可控酶解作用，释放隐藏于蛋白质分子内部的抗菌片段。
[0003]黄卿是我国南海、东海、黄海、渤海等海域常年捕获、产量较大的一种小型海水鱼，其蛋白质含量高达70%，是制备天然抗菌肽的优选原料。
[0004]大孔吸附树脂是集吸附和分离为一体的高分子分离材料，但是目前使用的大孔吸附树脂结构比较单一，存在对于目标组份筛分能力差的问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目标是设计制备磷脂功能化改性的大孔吸附树脂，利用它对黄鲫活性肽中的抗菌肽这一目标组份进行高效筛选，提供一种能够用于提取黄鲫活性肽中抗菌肽组份的可行方法，具体方案如下：一种海洋生物抗菌肽药物提取方法，所述提取方法为：首先利用内切酶断裂黄鲫蛋白生成活性肽组份，然后采用磷脂功能化改性D101大孔吸附树脂Rpf筛选出抗菌肽组份，其具体的制备步骤如下：步骤S1，把活性肽组份配制成活性肽溶液；步骤S2，称取100mg磷脂功能化改性D101大孔吸附树脂Rpf加入到100mL三角瓶Ⅰ中，向三角瓶Ⅰ中加入活性肽溶液，将其放置在恒温振荡器中震荡，震荡温度为30
‑
40℃、转速为150
‑
200r/min，把磷脂功能化改性D101大孔吸附树脂Rpf从三角瓶Ⅰ中取出之后加入到三角瓶Ⅱ中，向三角瓶Ⅱ中加入磷酸盐缓冲液，在温度30
‑
40℃、转速150
‑
200r/min下震荡，得到黄鲫抗菌肽组份。
[0006]优选的，所述磷脂功能化改性D101大孔吸附树脂Rpf的制备方法包括如下步骤：步骤S1，通过傅克反应以三溴化铝为催化剂、1,4
‑
二(溴甲基)苯为溴甲基化试剂，在D101大孔吸附树脂表面接枝溴甲基官能团制备得到溴甲基化D101大孔吸附树脂：步骤S2，通过4
‑
乙烯苯甲醛的醛基官能团与甘油磷脂的羟基官能团发生羟醛缩合反应制备得到烯基化磷脂单体Apm；步骤S3，采用原子转移自由基聚合法，以溴甲基化D101大孔吸附树脂的溴甲基官能团为诱发剂，在树脂表面接枝烯基化磷脂单体Apm，得到磷脂功能化改性D101大孔吸附树脂Rpf。
[0007]优选的，所述步骤S2：甘油磷脂为甘油磷脂酰胆碱、甘油磷酸酯中的一种。
[0008]优选的，所述磷脂功能化改性D101大孔吸附树脂Rpf为磷脂功能化改性D101大孔吸附树脂Rpf
‑Ⅰ
和/或磷脂功能化改性D101大孔吸附树脂Rpf
‑Ⅱ
。
[0009]优选的，所述磷脂功能化改性D101大孔吸附树脂Rpf为磷脂功能化改性D101大孔吸附树脂Rpf
‑Ⅲ
。
[0010]优选的，所述内切酶为胃蛋白酶或胰蛋白酶。
[0011]优选的，所述磷脂功能化改性D101大孔吸附树脂Rpf可以填充在层析柱中使用。
[0012]与现有技术相比，本专利技术具备以下有益的技术效果：首先设计合成磷脂功能化改性D101大孔吸附树脂Rpf，包括：磷脂功能化改性D101大孔吸附树脂Rpf
‑Ⅰ
、Rpf
‑Ⅱ
、Rpf
‑Ⅲ
；其中，Rpf
‑Ⅰ
和Rpf
‑Ⅲ
表面接枝的甘油磷脂酰胆碱能够通过静电效应、磷脂膜亲和作用两种吸附机制，高效筛选出黄鲫活性肽中的抗菌肽，通过筛选稳定性实验结果可知：Rpf
‑Ⅰ
的筛选稳定性能较佳；而Rpf
‑Ⅱ
表面接枝的甘油磷酸酯也能够通过磷脂膜亲和作用这一吸附机制，在一定程度上筛选出黄鲫活性肽中的抗菌肽；与仅通过预处理、未经磷脂功能化改性的D101大孔吸附树脂Rpf
‑
0相比，可知磷脂功能化改性D101大孔吸附树脂Rpf能够更加有效地筛选出黄鲫活性肽中的抗菌肽组份，即通过磷脂功能化改性提高了D101大孔吸附树脂对黄鲫活性肽中的抗菌肽这一目标组份的筛选能力。
附图说明
[0013]图1为溴甲基化D101大孔吸附树脂的化学结构式；其中R表示D101大孔吸附树脂；图2为烯基化磷脂单体Apm
‑Ⅰ
的化学结构式；图3为烯基化磷脂单体Apm
‑Ⅱ
的化学结构式；图4为磷脂功能化改性D101大孔吸附树脂Rpf
‑Ⅰ
的化学结构式；图5为磷脂功能化改性D101大孔吸附树脂Rpf
‑Ⅱ
的化学结构式。
具体实施方式
[0014]实施例1：制备溴甲基化D101大孔吸附树脂：通过傅克反应以三溴化铝为催化剂、1,4
‑
二(溴甲基)苯为溴甲基化试剂，在D101大孔吸附树脂表面接枝溴甲基官能团制备得到溴甲基化D101大孔吸附树脂，其具体的制备步骤如下：步骤S1
‑
1，D101大孔吸附树脂的预处理：取30gD101大孔吸附树脂，首先以无水乙醇溶液浸泡溶胀12h，然后依次使用浓度1%的HCI溶液和浓度4%的NaOH溶液洗涤，最后采用去离子水洗涤至中性，于
‑
20℃下真空冷冻干燥至恒重，得到D101大孔吸附树脂Rpf
‑
0；步骤S1
‑
2，称取15g步骤S1
‑
1制备的D101大孔吸附树脂Rpf
‑
0，加入到250mL三口烧瓶中，加入100mL N,N
‑
二甲基甲酰胺，在室温下浸泡溶胀10h，之后加入2g三溴化铝、15g1,4
‑
二(溴甲基)苯，置于恒温振荡器中在40℃下反应6h，反应结束后，依序采用去离子水、无水乙醇、丙酮、无水乙醇、去离子水洗涤，之后抽滤、置于
‑
20℃下真空冷冻干燥至恒重，得到溴甲基化D101大孔吸附树脂，其化学结构式如图1所示。
[0015]实施例2：合成烯基化磷脂单体Apm
‑Ⅰ
：通过4
‑
乙烯苯甲醛的醛基官能团与甘油磷脂酰胆碱
的羟基官能团发生羟醛缩合反应制备获得，其具体的制备步骤如下：步骤S2
‑
1，在装有回流冷凝管的100mL单口圆底烧瓶中，加入2g甘油磷脂酰胆碱、1.5g4
‑
乙烯苯甲醛、0.5mL浓度1mol/L盐酸催化剂、700mg十二烷基苯磺酸钠乳化剂和30mL去离子水，在80℃水浴下搅拌回流反应2h，冷却至25℃；步骤S2
‑
2，向步骤S2
‑
1制备的反应液中加入由30mL水和30mL正庚烷组成的两相体系，萃取弃去上层油相，水相使用30mL正庚烷继续萃取，真空旋蒸挥干溶剂，加入丙酮溶解后置于6℃下重结晶，重结晶产物置于20℃下本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种海洋生物抗菌肽药物提取方法，其特征在于，所述提取方法为：首先利用内切酶断裂黄鲫蛋白生成活性肽组份，然后采用磷脂功能化改性D101大孔吸附树脂Rpf筛选出抗菌肽组份，其具体的制备步骤如下：步骤S1，把活性肽组份配制成活性肽溶液；步骤S2，称取100mg磷脂功能化改性D101大孔吸附树脂Rpf加入到100mL三角瓶Ⅰ中，向三角瓶Ⅰ中加入活性肽溶液，将其放置在恒温振荡器中震荡，震荡温度为30
‑
40℃、转速为150
‑
200r/min，把磷脂功能化改性D101大孔吸附树脂Rpf从三角瓶Ⅰ中取出之后加入到三角瓶Ⅱ中，向三角瓶Ⅱ中加入磷酸盐缓冲液，在温度30
‑
40℃、转速150
‑
200r/min下震荡，得到黄鲫抗菌肽组份。2.根据权利要求1所述的一种海洋生物抗菌肽药物提取方法，其特征在于，所述磷脂功能化改性D101大孔吸附树脂Rpf的制备方法包括如下步骤：步骤S1，通过傅克反应以三溴化铝为催化剂、1,4
‑
二(溴甲基)苯为溴甲基化试剂，在D101大孔吸附树脂表面接枝溴甲基官能团制备得到溴甲基化D101大孔吸附树脂：步骤S2，通过4
‑
乙烯苯甲醛的醛基...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏伟，冷敦鹏，李华，臧学运，刘思喜，王友娟，李勤芳，
申请(专利权)人：青岛中仁动物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：