检测玉米细菌性枯萎病菌的方法及试剂盒技术

本发明专利技术大体涉及分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种检测玉米细菌性枯萎病菌的方法及试剂盒。本发明专利技术能够用于提高海关和基层实验室对玉米细菌性枯萎病菌的快速监测和检疫。通过实时荧光RPA反应，确定CLL001F/R引物的检测灵敏度为10 cfu/μL。模拟种子带菌和叶片针刺接种结果检测结果理想。与其他检测方法相比，RPA检测灵敏度高，检测时间短，易于操作，而且具有较高的灵敏性和特异性，适合玉米细菌性枯萎病菌的现场快速检疫。萎病菌的现场快速检疫。萎病菌的现场快速检疫。

【技术实现步骤摘要】
检测玉米细菌性枯萎病菌的方法及试剂盒


[0001]本专利技术大体涉及分子生物学
，具体而言，涉及一种检测玉米细菌性枯萎病菌的方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]玉米细菌性枯萎病菌（Pantoea stewartiisubsp.stewartii，PSS）是进境植物检疫性病原物之一，主要通过种子进行远距离传播，其引起的玉米细菌性枯萎病是玉米上的病害。
[0003]目前，PCR 广泛应用于进口玉米中PSS的快速检测，已经报道了多对特异引物或探针。由于PSS和P. stewartiisubsp. indologenes（PSI）的基因序列非常相近，多对PSS特异引物均可扩增PSI，造成假阳性的检测结果， 包括EPPO的PSS诊断标准采用的引物以及我国行业标准《SN/T 3756
‑
2013 玉米细菌性枯萎病菌检疫鉴定方法PCR方法》中采用的引物。

技术实现思路

[0004]本专利技术基于重组酶聚合酶扩增技术（RPA），通过收集的26株PSS及其相关菌株，对12对PSS特异引物/探针进行测试以评估引物/探针的特异性，最终建立了基于RPA的玉米细菌性枯萎病菌快速检测方法，满足（口岸）快速准确检测的需求。
[0005]本专利技术一方面涉及检测玉米细菌性枯萎病菌Pantoea stewartiisubsp. stewartii亚种的方法，其基于重组酶聚合酶扩增技术，且用于排除P. stewartiisubsp.indologenes亚种所造成的检测假阳性，所述方法包括采用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物对对待检测样品进行检测的步骤。
[0006]本专利技术的再一方面涉及如上所述的方法在区分玉米细菌性枯萎病菌Pantoea stewartiisubsp. stewartii亚种和P. stewartiisubsp.indologenes亚种中的应用。
[0007]本专利技术的又一方面涉及用于检测玉米细菌性枯萎病菌Pantoea stewartiisubsp. stewartii亚种的试剂盒，其包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物以及探针。
[0008]本专利技术能够用于提高海关和基层实验室对玉米细菌性枯萎病菌的快速监测和检疫。通过实时荧光RPA反应，确定CLL001F/R引物的检测灵敏度为10 cfu/μL。模拟种子带菌和叶片针刺接种结果检测结果理想。与其他检测方法相比，RPA检测灵敏度高，检测时间短，易于操作，而且具有较高的灵敏性和特异性，适合玉米细菌性枯萎病菌的现场快速检疫。
附图说明
[0009]为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0010]图1为引物特异性RPA检测；取26个玉米上的病原菌进行鉴定，确定引物和探针特
异性非常好，五个阳性菌株全部检测出来。
[0011]图2为引物灵敏度RPA检测结果；其中菌液梯度稀释，最低检测浓度为10 cfu/μL。
[0012]图3为模拟种子和叶片带菌RPA检测；A.模拟种子带菌实验，将过夜活化的菌洗涤后调整OD600为0.6（约108cfu/ml），然后进行梯度稀释后用菌液浸泡种子6h，烘干后，加入1ml的水浸泡种子4h，然后揉搓，取2μL进行RPA实验；B.玉米叶片带菌检测，针刺病斑处CT值19，稍远处的CT值29.9。
具体实施方式
[0013]现将详细地提供本专利技术实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本专利技术。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本专利技术进行多种修改和变化而不背离本专利技术的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
[0014]除非另有说明，用于披露本专利技术的所有术语(包括技术和科学术语)的意义与本专利技术所属领域普通技术人员所通常理解的相同。通过进一步的指导，随后的定义用于更好地理解本专利技术的教导。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。
[0015]本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项（也即均用“逻辑或”连接的技术方案），也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合（也即均用“逻辑与”连接的技术方案）。
[0016]本专利技术中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词，其是包容性或开放式的，不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。
[0017]本专利技术中用端点表示的数值范围包括该范围内所包含的所有数值及分数，以及所引述的端点。
[0018]本专利技术中涉及浓度数值，其含义包括在一定范围内的波动。比如，可以在相应的精度范围内波动。比如2%，可以允许
±
0.1%范围内波动。对于数值较大或无需过于精细控制的数值，还允许其含义包括更大波动。比如100mM，可以允许
±
1%、
±
2%、
±
5%等范围内的波动。涉及分子量，允许其含义包括
±
10%的波动。
[0019]本专利技术中，涉及“多个”、“多种”等描述，如无特别限定，指在数量上指大于等于2。
[0020]本专利技术中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
[0021]本专利技术中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施
例，应当理解，并不构成对本专利技术保护范围的限制。本专利技术中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。
[0022]在本专利技术提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本申请的专利技术目的和/或技术方案相冲突，否则，本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 检测玉米细菌性枯萎病菌Pantoea stewartii subsp. stewartii亚种的方法，其基于重组酶聚合酶扩增技术，且用于排除P. stewartii subsp. indologenes亚种所造成的检测假阳性，所述方法包括采用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物对对待检测样品进行检测的步骤。2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还采用如下所示的探针：CATGGTGTCGTATTTTAGGTAAATAAGTTGTTTAG[发光基团][脱碱基核苷酸类似物]GT[淬灭基团]TTTTTTCGCCATGCCG[阻断剂]；所述阻断剂用于阻断探针的聚合酶延伸。3.根据权利要求2所述的方法，所述脱碱基核苷酸类似物为四氢呋喃。4.根据权利要求2所述的方法，所述阻断剂为间臂。5.根据权利要求4所述的方法，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵文军，蔡璐璐，田茜，许沛冬，孟青青，陈迪，潘磊，马云龙，孙羽佳，
申请(专利权)人：三亚中国检科院生物安全中心，
类型：发明
国别省市：