RASSF1基因的甲基化检测试剂和方法技术

本发明专利技术涉及基因的甲基化检试剂和方法。本发明专利技术提供一种寡核苷酸接头，从5

【技术实现步骤摘要】
RASSF1基因的甲基化检测试剂和方法


[0001]本专利技术涉及RASSF1基因的甲基化检试剂和方法。

技术介绍

[0002]目前，主流的cfDNA甲基化检测方法是基于重亚硫酸盐转化的方法。但是，该方法存在许多不足：1、经转化的DNA样本需要经受低pH、高温、高浓度的重亚硫酸盐等，这些条件会导致DNA大量降解，导致所需的cfDNA起始用量较大；2、重亚硫酸盐处理不彻底会导致未甲基化的胞嘧啶转化不完全，出现假阳性的结果；3、未甲基化的胞嘧啶约占人基因组总胞嘧啶数的95％，将未甲基化的胞嘧啶全部转换为尿嘧啶则会严重降低序列复杂性，在对多种靶标分子进行同时检测时，引物设计更困难，导致检测准确性降低，并且增加检测成本；4、重亚硫酸盐转化处理时间长、后续需要反复洗涤纯化、操作繁琐，耗费大量的人力和时间。
[0003]鉴于现有技术的上述缺陷，本领域需要一种无需重亚硫酸盐转化并且特异性好、灵敏度高的甲基化检测方法。

技术实现思路

[0004]专利技术人发现利用位点特异性切割核酸酶的核酸检测体系，可实现对微量cfDNA的RASSF1基因甲基化检测，无需重亚硫酸盐转化、特异性好、灵敏度高。
[0005]本专利技术第一方面提供一种寡核苷酸接头或其核酸类似物修饰变体，所述寡核苷酸接头从5
’
到3
’
包含结合序列和如下任一所示的靶标互补序列：SEQ ID NO:1第23
‑
36位、SEQ ID NO:7第23
‑
35位、SEQ ID NO:8第23
‑
43位、SEQ ID NO:9第23
‑
43位，所述结合序列包含与捕获寡核苷酸的3
’
末端序列至少部分相同的序列。
[0006]在一个或多个实施方案中，所述寡核苷酸接头还包括核酸延伸阻断修饰。
[0007]在一个或多个实施方案中，所述核酸延伸阻断修饰位于寡核苷酸接头的3
’
端。
[0008]在一个或多个实施方案中，所述核酸延伸阻断修饰包括选自以下的一种或多种：Spacer、硫代基团、巯基、氨基或尿嘧啶碱基。
[0009]在一个或多个实施方案中，所述寡核苷酸接头的靶标互补序列用于和靶标分子结合。
[0010]在一个或多个实施方案中，所述靶标分子是选自甲基化依赖型限制性内切酶、甲基化敏感性限制性内切酶、限制性内切酶、切口酶、CRISPR
‑
Cas体系或错配修复酶中一种或多种酶的酶切产物。
[0011]在一个或多个实施方案中，所述甲基化依赖型限制性内切酶包括选自GlaI、FspEI、MspJI和LpnPI中的任意一种或两种或更多种。
[0012]在一个或多个实施方案中，所述寡核苷酸接头如SEQ ID NO:1、7
‑
9中任一所示。
[0013]在一个或多个实施方案中，核酸类似物修饰位于靶标互补序列。优选地，所述核酸类似物包括选自以下的一种或多种：肽核酸、锁核酸、2'
‑
O，4'
‑
C
‑
甲基化架桥RNA、2'
‑
甲氧
基修饰碱基、2'
‑
O
‑
甲基RNA或2'
‑
氟代RNA。
[0014]本专利技术第二方面还提供一种捕获寡核苷酸或其核酸类似物修饰变体，所述捕获寡核苷酸从5
’
到3
’
包括第一通用序列、折叠序列和结合捕获序列，其中，所述折叠序列具有如SEQ ID NO:2中第18
‑
31位所示的序列，所述结合捕获序列与本文所述的寡核苷酸接头的结合序列至少部分相同，任选地，所述捕获寡核苷酸在折叠序列和结合捕获序列之间还包含第二通用序列。
[0015]在一个或多个实施方案中，第一通用序列如SEQ ID NO:2第1
‑
17位所示。
[0016]在一个或多个实施方案中，第二通用序列如SEQ ID NO:2第32
‑
48位所示。在一个或多个实施方案中，结合捕获序列如SEQ ID NO:2第49
‑
70位所示
[0017]在一个或多个实施方案中，所述核酸类似物修饰位于第一通用序列、折叠序列、第二通用序列或其组合。
[0018]在一个或多个实施方案中，所述核酸类似物修饰能用于降低被修饰核酸与其配对核酸之间连接的稳定性。
[0019]在一个或多个实施方案中，所述核酸类似物包括脱氧尿嘧啶核苷(deoxyuridine dU)。
[0020]在一个或多个实施方案中，所述捕获寡核苷酸的核酸类似物修饰变体如SEQ ID NO:10所示。
[0021]在一个或多个实施方案中，所述捕获寡核苷酸还包括核酸延伸阻断修饰。
[0022]在一个或多个实施方案中，所述核酸延伸阻断修饰位于折叠序列的3
’
端。
[0023]在一个或多个实施方案中，所述核酸延伸阻断修饰位于第二通用序列的5
’
端。
[0024]在一个或多个实施方案中，所述核酸延伸阻断修饰包括选自以下的一种或多种：Spacer、硫代基团、巯基、氨基或尿嘧啶碱基。
[0025]在一个或多个实施方案中，所述捕获寡核苷酸如SEQ ID NO:2或10所示。
[0026]本专利技术第三方面还提供一种核酸检测组合物或试剂盒，所述组合物或试剂盒包括本文任一实施方案所述的捕获寡核苷酸和本文任一实施方案所述的寡核苷酸接头。
[0027]在一个或多个实施方案中，所述组合物或试剂盒还包括位点特异性切割核酸酶；优选核酸外切酶和/或核酸内切酶。
[0028]在一个或多个实施方案中，所述核酸内切酶选自甲基化依赖型限制性内切酶、甲基化敏感性限制性内切酶、限制性内切酶、切口酶、CRISPR
‑
Cas体系或错配修复酶中的任意一种或多种。
[0029]在一个或多个实施方案中，所述甲基化依赖型限制性内切酶包括选自GlaI、FspEI、MspJI和LpnPI中的任意一种或两种或更多种。
[0030]在一个或多个实施方案中，所述组合物或试剂盒还包括：
[0031](1)通用引物，所述通用引物(I)包含与结合捕获序列相同或部分相同的序列；优选地，通用引物3
’
端序列与结合捕获序列或其部分序列相同，或者(II)包含与结合捕获序列和第二通用序列的串联序列相同或部分相同的序列；优选地，通用引物3
’
端序列与(a)或(b)相同：(a)结合捕获序列或第二通用序列或二者的串联序列，(b)(a)的部分序列；更优选地，通用引物从5
’
到3
’
包括以下序列：第二通用序列或其3
’
端部分序列和/或第一结合序列或其5
’
端部分序列；优选地，通用引物如SEQ ID NO:4所示；和/本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种寡核苷酸接头或其核酸类似物修饰变体，其特征在于，所述寡核苷酸接头从5
’
到3
’
端包含结合序列和如下任一所示的靶标互补序列：SEQ ID NO:1第23
‑
36位、SEQ ID NO:7第23
‑
35位、SEQ ID NO:8第23
‑
43位、SEQ ID NO:9第23
‑
43位，所述结合序列包含与捕获寡核苷酸的3
’
末端序列至少部分相同的序列，优选地，所述寡核苷酸接头具有选自以下的一个或多个特征：所述寡核苷酸接头如SEQ ID NO:1、7
‑
9中任一所示，所述寡核苷酸接头还包括核酸延伸阻断修饰，所述核酸延伸阻断修饰位于寡核苷酸接头的3
’
端，所述核酸延伸阻断修饰包括选自以下的一种或多种：Spacer、硫代基团、巯基、氨基或尿嘧啶碱基，所述核酸类似物修饰位于靶标互补序列，所述核酸类似物包括选自以下的一种或多种：肽核酸、锁核酸、2'
‑
O，4'
‑
C
‑
甲基化架桥RNA、2'
‑
甲氧基修饰碱基、2'
‑
O
‑
甲基RNA或2'
‑
氟代RNA。2.一种捕获寡核苷酸或其核酸类似物修饰变体，其特征在于，所述捕获寡核苷酸从5
’
端到3
’
端依次包括第一通用序列、折叠序列和结合捕获序列，其中，所述折叠序列具有如SEQ ID NO:2中第18
‑
31位所示的序列，所述结合捕获序列与权利要求1所述的寡核苷酸接头的结合序列至少部分相同，优选地，所述捕获寡核苷酸或其核酸类似物修饰变体具有选自以下的一个或多个特征：第一通用序列如SEQ ID NO:2第1
‑
17位所示，结合捕获序列如SEQ ID NO:2第49
‑
70位所示，所述核酸类似物包括脱氧尿嘧啶核苷，所述捕获寡核苷酸的修饰变体如SEQ ID NO:10所示，所述捕获寡核苷酸还包括核酸延伸阻断修饰，所述核酸延伸阻断修饰包括选自以下的一种或多种：Spacer、硫代基团、巯基、氨基或尿嘧啶碱基。3.一种核酸检测组合物或试剂盒，其特征在于，所述组合物或试剂盒包括权利要求1所述的寡核苷酸接头和权利要求2所述的捕获寡核苷酸，优选地，所述组合物或试剂盒还包括甲基化依赖型限制性内切酶、甲基化敏感性限制性内切酶、限制性内切酶、切口酶、CRISPR
‑
Cas体系或错配修复酶中的任意一种或多种，和/或所述组合物或试剂盒还包括通用引物，和/或所述组合物或试剂盒还包括特异引物，和/或所述组合物或试剂盒还包括探针；优选地，所述探针标记有荧光基团和/或淬灭基团，和/或所述组合物或试剂盒还包括酶切缓冲液、PCR缓冲液、探针、DNA聚合酶、dNTP或Mg
2+
中的任意一种或多种。4.一种核酸检测体系，其特征在于，所述体系包括：至少1nM权利要求2所述的捕获寡核苷酸、1～100nM权利要求1所述的寡核苷酸接头、1～5U Taq聚合酶、50～500μM dNTP、1～
...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐宏，丘佳妮，杨浩，徐高连，古宏晨，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：