基于贵金属原位生长的免疫荧光信号增强方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种基于贵金属原位生长的免疫荧光信号增强方法及试剂盒，在标志物的位置标记贵金属纳米粒子，并原位生长出贵金属纳米基底，使用空间栅栏使贵金属纳米基底与荧光材料保持恰当的距离，避免荧光的猝灭，实现荧光信号的放大，解决了现在贵金属纳米粒子难以应用于免疫荧光领域的问题。区别于以往的免疫荧光信号增强技术，该技术不需要酶的帮助、不需要特殊标记的二抗、不需要经过核扩增即可实现荧光信号的放大，且信号放大倍数高，可以显著提高检测的灵敏度。提高检测的灵敏度。提高检测的灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
基于贵金属原位生长的免疫荧光信号增强方法及试剂盒


[0001]本专利技术涉及免疫荧光检测
，尤其涉及一种基于贵金属原位生长的免疫荧光信号增强方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术，可以利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。为了满足检测表达量比较少的抗原的需求，常规的免疫荧光检测灵敏度不够，通常需要对荧光信号进行放大。
[0003]目前免疫荧光领域的信号放大技术主要包括基于抗体的信号放大技术，如基于生物素
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亲和素的信号放大技术、基于半抗原(表位标签)的信号放大技术；基于酶促反应的信号放大技术，如酪氨酸信号放大技术(TSA)、Power Styramide信号放大技术(PSA)、酶促进聚多巴胺的超快沉积技术(EASE)；基于纳米粒子的信号放大技术，如金纳米粒子技术；基于核酸的信号放大技术，如基于杂交链反应的信号放大技术(isHCR)、通过交换反应进行信号放大的免疫染色技术(Immuno
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SABER)。
[0004]在这些现有技术中，基于生物素
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亲和素的信号放大技术由于组织中内源性生物素的存在可以显著增加背景信号，且信号放大倍数不显著；基于半抗原(表位标签)的信号放大技术信号放大倍数也不显著；酪氨酸信号放大技术(TSA)是现在免疫荧光领域最常用的信号放大技术，但是成像过程需反复去除二抗，操作麻烦，操作时间长，有信号模糊或分辨率降低的风险，对于高丰度蛋白，可能导致荧光信号过度曝光，弥散；Power Styramide信号放大技术和TSA技术一样，有信号模糊或分辨率降低的风险，对于高丰度蛋白，可能导致荧光信号过度曝光，弥散；酶促进聚多巴胺的超快沉积技术(EASE)聚多巴胺与后续加入的HRP是物理吸附，结合率低下，多巴胺本身的非特异性自聚速度非常快，可能导致背景信号的提高，多巴胺在溶液中易氧化，存在保存问题，且EASE体系需要用到氨基修饰的量子点，价格昂贵，与现有体系存在兼容性问题；基于核酸的信号放大技术(如isHCR、Immuno
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SABER等)需要抗体与核酸的链接、核酸扩增、荧光的孵育等过程操作麻烦，还处于起步阶段。
[0005]基于纳米粒子的信号放大技术是一种区别于上述技术的发展方向，其中，基于贵金属纳米粒子局域表面等离激元共振效应(LSPR：localized surface plasmon resonance)的荧光信号放大技术由于不需要酶促反应、不需要特异性的表位标签、不需要额外的核酸扩增，通过贵金属纳米粒子本身的特性(LSPR、避雷针效应)即可实现荧光信号的放大，即表面增强荧光(SEF：Surface Enhanced Fluorescence)，因而逐渐引起人们的重视。
[0006]贵金属纳米粒子实现信号放大的原理如下：在一个确定的检测系统中，检测到的荧光强度只与两个因素有关，一个是荧光基团的激发速率，另一个是荧光基团的量子产率。对于一个特定的检测系统，如果需要提高它检测到的荧光强度可以从提高荧光基团激发速率以及提高荧光基团的量子产率这两个方面入手。而根据费米黄金定律，荧光基团激发速率与荧光基团所处位置的电场强度的平方成正比，因此提高荧光基团激发速率的关键在于
提高荧光分子所在位置的电场强度。而提高荧光基团所处位置的荧光强度主要有两种方法，第一种是LSPR效应，即当一定波长的光照射到贵金属纳米粒子或者具有特定纳米结构的金属表面上时，如果入射光的频率与金属纳米结构中自由电子的集体振荡频率匹配时，金属纳米结构会对该频率的光产生强烈的共振吸收作用，从而在金属表面附近产生很强的局域电场；第二种是避雷针效应，即在一些纳米结构的尖端或者它们之间的窄隙中，也会存在着很强的局域电场。而根据Lakowicz等人创建的“辐射等离子体”模型，荧光量子产率的大小取决于辐射跃迁与非辐射跃迁过程的竞争结果。辐射跃迁所占的能量比重越高，其量子产率就越高。因此为了提高荧光分子的量子产率，我们应该设法提高荧光分子辐射跃迁能量的占比，降低其非辐射跃迁能量的占比。而利用表面等离激元共振效应能很好地实现这一点。因为被激发的荧光分子以非辐射的形式迅速将能量转移到金属表面的过程中可能激发起损耗——表面波以欧姆热的形式在金属中被损耗，但也可能激发起金属表面等离子激元(SPR)，将能量重新辐射至远场，从而提高量子产率。
[0007]尽管贵金属纳米粒子在荧光信号放大方面有着很大的应用前景，但是贵金属纳米粒子却很少用于免疫荧光的信号放大领域。因为贵金属纳米粒子实现荧光信号的增强具有很强的距离效应，当荧光基团与表面等离激元的距离小于5nm时主要表现为荧光猝灭现象(所以LSPR目前更多应用在表面拉曼增强(SERS)领域)，当荧光基团与表面等离激元之间的距离在5nm
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20nm之间时，主要表现为荧光增强现象。为了保持合适的距离，通常使用贵金属纳米粒子作为基底，上面孵育多层抗体或者高分子聚合物保持一定的距离以实现荧光增强，但是由于需要预先制备贵金属纳米粒子的基底，因此这种方法无法应用于免疫荧光的原位检测。为了将贵金属纳米粒子的荧光增强应用于免疫荧光领域，香港大学的研究者们提出了一个二抗标记金纳米粒子，另一个二抗标记荧光基团的双二抗体系实现了荧光的3倍增强(Chemical Communications,2019,55(19):2761
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2764)。但是由于二抗是随机和一抗发生反应的，因此该技术无法控制金纳米粒子和荧光基团之间的位置，荧光基团可能和金纳米粒子相距过远而无法增强荧光，也可能和金纳米粒子相距过近而发生荧光猝灭，因此该方法实现的荧光放大倍数并不显著；此外，对于表达量很少的抗原，很可能由于没有聚集出现的抗原，导致没有聚集出现的金纳米粒子以及没有聚集出现的荧光基团，这就使得该方法不适用于这些低丰度抗原，而低丰度抗原恰恰是最需要信号放大的标志物，这就使得该方法的实用价值受到影响。
[0008]因此，尽管贵金属纳米粒子可以增强荧光信号，但实际上由于标记荧光的抗体与贵金属纳米粒子之间的距离难以控制，使其难以在免疫组织化学和免疫荧光领域充分发挥效果。

技术实现思路

[0009]为解决现有技术的不足，本专利技术提出一种基于贵金属原位生长的免疫荧光信号增强方法及试剂盒，在标志物的位置标记贵金属纳米粒子，并原位生长出贵金属纳米基底，使用空间栅栏使贵金属纳米基底与荧光材料保持恰当的距离，避免荧光的猝灭，实现荧光信号的放大，解决了现在贵金属纳米粒子难以应用于免疫荧光领域的问题。区别于以往的免疫荧光信号增强技术，该技术不需要酶的帮助、不需要特殊标记的二抗、不需要经过核扩增即可实现荧光信号的放大，且信号放大倍数高，可以显著提高检测的灵敏度。
[0010]为实现以上目的，本专利技术所采用的技术方案包括：
[0011]一种基于贵金属原位生长的免疫荧光信号增强方法，其特征在于，包括：
[0012]S1、样本制备；
[0013]S2、孵育本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于贵金属原位生长的免疫荧光信号增强方法，其特征在于，包括：S1、样本制备；S2、孵育贵金属纳米粒子标记的反应物；S3、贵金属纳米粒子原位生长形成贵金属纳米基底；S4、在贵金属纳米粒子基底上添加空间栅栏并孵育荧光材料；S5、使用激发光进行荧光成像，获得增强后的免疫荧光信号。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述贵金属纳米粒子包括含有金、银、钌、铑、钯、锇、铱和/或铂元素的纳米粒子。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述贵金属纳米粒子包括金纳米粒子、银纳米粒子、金核银壳纳米粒子、银核金壳纳米粒子或其组合。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应物包括能够定位目标标志物的物质。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述反应物包括能够定位目标标志物并发生特异性反应的物质。6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述反应物包括抗体、核酸、配体的任意一种或多种组合。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S3包括：加入含有贵金属离子的反应液和还原剂，以贵金属纳米粒子作为还原反应的起始位点及催化剂进行还原反应生成贵金属，形成贵金属纳米基底。8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述贵金属纳米基底的投影面积为0.5nm2至800000nm2。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述贵金属纳米基底的投影面积为300nm2至200000nm2。10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述空间栅栏为能够与荧光材料连接，且可以直接或间接与贵金属纳米粒子发生相互作用形成连接的物质；或，所述空间栅栏为与荧光材料一体的，且可以直接或间接与贵金属纳米粒子发生相互作用形成连接的物质。11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述空间栅栏为能够与荧光材料发生特异性反应，且可以直接或间接与贵金属纳米粒子发生相互作用生成连接键的物质；或，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：盛滔，张亚楠，
申请(专利权)人：上海思路迪生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：