用于检测样品中抗体的基于细胞的分析制造技术

提供了确定样品是否包含与冠状病毒抗原结合的抗体的方法。方法的方面可包括：组合样品、在其表面上显示与抗体特异性结合的冠状病毒抗原的抗原决定簇的哺乳动物细胞和与抗体结合的标记的第二结合成员，以产生分析组合物；以及以流式细胞术分析该分析组合物的来自标记的第二结合成员的信号的存在，以确定样品是否包含抗体。还提供了评估受试者对冠状病毒感染的免疫应答的方法和产生在其表面上显示冠状病毒抗原的抗原决定簇的哺乳动物细胞的方法。还提供了用于实施本发明专利技术方法的系统、表达载体、哺乳动物细胞和试剂盒。哺乳动物细胞和试剂盒。哺乳动物细胞和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于检测样品中抗体的基于细胞的分析
[0001]交叉引用
[0002]根据35U.S.C.
§
119(e)，本申请要求2020年9月22日提交的美国临时专利申请序列号63/081,647的申请日的优先权；该申请的公开内容通过引用全部并入本文。
[0003]介绍
[0004]冠状病毒是有包膜的正义单链RNA病毒。在已知的RNA病毒中，它们拥有最大的基因组(26
‑
32kb)，在种系发生学上分为四个属(α、β、γ、δ)，其中β冠状病毒进一步细分为四个谱系(A、B、C、D)。冠状病毒感染多种鸟类和哺乳动物物种，包括人类。在六种已知的人冠状病毒中，其中有四种(HCoV
‑
OC43、HCoV
‑
229E、HCoV
‑
HKU1和HCoV
‑
NL63)每年都在人类中传播，通常会引起轻微的呼吸道疾病，尽管婴儿、老年人和免疫力低下者的严重程度可能更高。相比之下，分别属于β冠状病毒谱系C和B的中东呼吸综合征冠状病毒(MERS
‑
CoV)和严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS
‑
CoV)是高度致病性的。
[0005]新型冠状病毒(2019
‑
nCoV/SARS
‑
CoV
‑
2)引发了呼吸道疾病大暴发。现在这种疾病是全球性流行病，几乎没有减弱的迹象。从分类学上讲，SARS
‑
CoV
‑
2是β冠状病毒，被认为是谱系A或C(Jaimes等,"Phylogenetic Analysis and Structural Modeling of SARS
‑
CoV
‑
2Spike Protein Reveals an Evolutionary Distinct and Proteolytically Sensitive Activation Loop(SARS
‑
CoV
‑
2刺突蛋白的种系发生分析和结构建模揭示了进化独特和蛋白质水解敏感的活化环),"J.Mol.Biol.(5月1日,2020)432(10):3309
–
3325)。由SARS
‑
CoV
‑
2引起的疾病COVID
‑
19可以表现出许多临床症状，包括肺炎、发热、干咳、头痛和呼吸困难。在一些情况下，该疾病可能进展为呼吸衰竭和死亡。Id.
[0006]用于确定患者是否患有COVID
‑
19的诊断测试是一种实时逆转录聚合酶链反应(RT
‑
PCR)测试，用于定性检测呼吸道样品中来自SARS
‑
CoV
‑
2的核酸。该测试用于鉴定患者样品中的SARS
‑
CoV
‑
2RNA，阳性测试结果表明患者患有活动性冠状病毒感染。在典型的方案中，患者或健康护理提供者使用拭子从患者的鼻子或咽喉收集呼吸道样品。将拭子置于密封的无菌容器中并在72小时内转送至实验室。在实验室，从拭子中提取病毒RNA并进行RT
‑
PCR，其中将病毒RNA逆转录成DNA，然后使用对病毒基因组的区域有特异性的引物进行扩增。然后可以用与DNA结合时提供荧光信号的探针指示DNA的存在。RT
‑
PCR测试可以施用于个体样品包括自收集的鼻拭子样本或混合样品。

技术实现思路

[0007]响应于SARS
‑
CoV
‑
2感染而产生的免疫力的持续时间和性质尚不清楚。目前SARS
‑
CoV
‑
2检测的策略是基于逆转录聚合酶链反应(RT
‑
PCR)，并且没有提供关于宿主对病毒的免疫应答的信息。此外，基于RT
‑
PCR的试验没有表明无症状患者是否具有针对SARS
‑
CoV
‑
2的抗体或免疫力。
[0008]提供了确定样品是否包含与冠状病毒抗原结合的抗体的方法。方法的各方面可以包括组合样品、在其表面上显示与所述抗体特异性结合的冠状病毒抗原的抗原决定簇的哺乳动物细胞和与抗体结合的标记的第二结合成员，以产生分析组合物。然后以流式细胞术
分析所得的分析组合物的来自标记的第二结合成员的信号的存在，以确定样品是否包含抗体。还提供了评估受试者对冠状病毒感染的免疫应答的方法和产生在其表面上显示冠状病毒抗原的抗原决定簇的哺乳动物细胞的方法。并提供了用于实施本专利技术方法的系统、表达载体、哺乳动物细胞和试剂盒。
附图说明
[0009]图1提供了膜锚定蛋白的实施方案的示意图。
[0010]图2提供了表达载体的实施方案的示意图。
[0011]图3描绘了根据某些实施方案的流式细胞仪。
[0012]图4提供了对冠状病毒抗原有特异特性的抗体的基于细胞的血清学分析的实施方案的示意图。
[0013]定义
[0014]如本文所用，术语“抗原(Ag/antigen)”是指能够与免疫球蛋白分子的抗原结合区结合或能够引发免疫应答的物质。本文所用的“抗原”包括但不限于抗原决定簇、半抗原和免疫原，它们可以是肽、小分子、碳水化合物、脂质、核酸或它们的组合。熟练的免疫学家将认识到，当讨论被加工用于递呈给T细胞的抗原时，术语“抗原”是指作为由MHC递呈给T细胞受体的T细胞表位的抗原的那些部分(例如肽片段)。当用在对“抗原”(与抗体(轻和重)可变区的互补决定区结合的抗原的部分)有特异性的抗体形式的B细胞介导的免疫应答的情况时，所述结合的部分可以是线性表位或三维表位。
[0015]本文所用的术语“抗原决定簇”或“表位”在其常规意义上是指与免疫球蛋白或抗体(或其抗原结合片段)特异性结合的抗原上的位点。表位可以由连续氨基酸或通过蛋白质的三级折叠而并置的非连续氨基酸形成。在暴露于变性溶剂时由连续氨基酸形成的表位通常保留，而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位通常包括成独特空间构象的3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括例如X射线晶体学和二维核磁共振。参见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology(分子生物学方法中的表位映射方案),第66卷,G.E.Morris,编辑(1996)。
[0016]如本文所用，术语“冠状病毒”以其常规含义使用时是指分类在网巢病毒目(Nidovirales)内的来自包膜、单链、正链RNA病毒家族的病毒。冠状病毒基因组编码四种主要结构蛋白：刺突(S)蛋白、核衣壳(N)蛋白、膜(M)蛋白和包膜(E)蛋白，它们通常都是产生结构完整的病毒颗粒所必需的。冠状病毒的结构进一步描述于Schoeman and Fielding(本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种确定样品是否包含与冠状病毒抗原结合的抗体的方法，所述方法包括：(a)组合如下项以产生分析组合物：(i)所述样品；(ii)哺乳动物细胞，在其表面上显示与所述抗体特异性结合的冠状病毒抗原的抗原决定簇；以及(iii)与所述抗体结合的标记的第二结合成员；以及(b)以流式细胞术分析所述分析组合物的来自所述标记的第二结合成员的信号的存在，以确定所述样品是否包含所述抗体。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述抗原决定簇是膜锚定蛋白的组分。3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述膜锚定蛋白包括跨膜蛋白或脂质锚。4.根据权利要求2
‑
3中任一项所述的方法，其中，所述膜锚定蛋白包含可检测结构域，所述可检测结构域优选荧光蛋白。5.根据权利要求1
‑
4中任一项所述的方法，其中，所述哺乳动物细胞包含编码所述冠状病毒抗原的抗原决定簇的表达构建体。6.根据权利要求1
‑
5中任一项所述的方法，其中，所述冠状病毒抗原来源于SARS
‑
CoV、MERS
‑
CoV或SARS
‑
CoV
‑
2。7.根据权利要求1
‑
6中任一项所述的方法，其中，所述冠状病毒抗原包括刺突蛋白、包膜蛋白、膜蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：奥列格，
申请(专利权)人：贝克顿，
类型：发明
国别省市：