一种基于环糊精-金刚烷化铱络合物主客体组装标记的蛋白标记物荧光检测方法技术

本发明专利技术涉及一种基于环糊精

【技术实现步骤摘要】
一种基于环糊精
‑
金刚烷化铱络合物主客体组装标记的蛋白标记物荧光检测方法


[0001]本专利技术涉及有机金属络合物催化、功能材料制备及生物荧光传感
，具体地说，涉及有机金属铱络合物催化加氢反应，有机金属铱络合物及超分子化合物β
‑
环糊精对金纳米颗粒的主客体自组装，进而，涉及有机金属铱络合物功能化金纳米颗粒在生物蛋白标记物检测中的应用。

技术介绍

[0002]面对人类日益复杂的健康安全问题，以及人们对自身健康的高质量追求，开发更多灵敏、稳定的、适应多种复杂情况的新型疾病检测技术显得尤为重要和迫切。在现有疾病检测技术中，酶联免疫吸附法（Enzyme
‑
Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）由于其检测成本低，操作简便已经被用于几乎所有疾病的临床应用中，尤其适用于疾病的初期定性诊断与大面积体检。虽然ELISA检测方法拥有众多优点，但受限于酶自身催化活性、热稳定性以及催化底物，该方法在检测灵敏度、稳定性方面仍然面临众多不足，特别是对于癌症早期诊断方面应用相对产品匮乏。基于此，在ELISA检测方法的基础上，探寻高活性、高稳定性的酶替代产品，将有望开发更加灵敏、稳定的疾病检测方法。
[0003]本专利技术开发了一系列高稳定、高催化活性的环糊精
‑
金刚烷化铱络合物自组装标记策略标记纳米颗粒，并采用其代替传统ELISA检测方法中的酶，通过对标记抗体和金刚烷功能化铱络合物对纳米材料的修饰顺序进行严格控制，成功解决了金属铱络合物在检测方法构建中容易巯基失活的不可逆问题，进一步结合与金属铱络合物特异性响应的加氢调控荧光探针，并结合传统的ELISA检测技术，构建了一种高稳定的蛋白标记物荧光检测方法。

技术实现思路

[0004]为解决有机金属铱络合物加氢催化剂在疾病标记物检测应用中易巯基中毒的关键技术问题，本专利技术研究了一种基于环糊精
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金刚烷化铱络合物的自组装标记策略，以金纳米颗粒（AuNPs）、银纳米颗粒（AgNPs）、聚苯乙烯微球（PS）或二氧化硅微球（SiO2）作为载体，采用有机金属铱络合物后修饰策略，成功解决了常规封闭剂胎牛血清蛋白BSA对催化剂的影响，进一步结合高灵敏响应的加氢调控荧光探针，以及传统的ELISA分析技术，构建了一种新型的疾病标记物荧光检测方法。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采取了以下技术方案。
[0006]一种环糊精
‑
金刚烷化铱络合物主客体组装标记的蛋白标记物荧光检测方法。
[0007]包括以下步骤：（1）、 环糊精
‑
金刚烷化铱络合物、标记抗体Ab1共同标记纳米材料的制备; （2）、 以酶标板或磁珠作为载体，依次采用包被抗体对其进行包被、封闭剂封闭、进而结合相应的待测抗原；（3）、向步骤（2）所的到的抗原载体材料中加入定量且过量的步骤（1）得到的纳米材料，孵化后得到去除过量的纳米材料；（4）、向步骤（3）所得到的标记材料中加入含有加氢调控荧光探针的荧光检测液，金属铱络合物催化剂能够催化荧光探针分
子产生荧光信号，进而通过检测检测液的荧光强度可实现对被测抗原生物蛋白标记物的定量检测。
[0008]步骤（1）环糊精
‑
金刚烷化铱络合物、标记抗体Ab1共同标记纳米材料的制备，包含如下步骤：1）、以金纳米颗粒（AuNPs）、银纳米颗粒（AgNPs）、聚苯乙烯微球（PS）或二氧化硅微球（SiO2）为载体，首先与标记抗体Ab1以一定比例直接混合修饰或采用缩合剂(1
‑
乙基
‑
（3
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二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐EDCI、N
‑
羟基琥珀酰亚胺NHS)活化后偶联，得到Ab1标记的纳米材料AuNPs@Ab1或 AgNPs@Ab1或PS@Ab1或 SiO2@Ab1；2）、将AuNPs@Ab1或 AgNPs@Ab1或PS@Ab1或 SiO2@Ab1进一步与巯基或双硫键或氨基功能化β
‑
环糊精混合振荡2到24小时，接着采用封闭剂胎牛血清蛋白（BSA）或脱脂奶粉或酪蛋白或吐温进行孵化封闭后得到环糊精功能化的Ab1标记的金纳米颗粒 AuNPs
‑
Ab1@CD或AgNPs
‑
Ab1@CD或PS
‑
Ab1@CD或SiO2‑
Ab1@CD；3）、将AuNPs
‑
Ab1@CD或AgNPs
‑
Ab1@CD 或PS
‑
Ab1@CD或SiO2‑
Ab1@CD在金刚烷化铱络合物溶液中孵化1
‑
24小时，得到环糊精
‑
金刚烷主客体修饰的铱络合物标记纳米材料AuNPs
‑
Ab1@CD@Ir或AgNPs
‑
Ab1@CD@Ir或PS
‑
Ab1@CD@Ir或SiO2‑
Ab1@CD@Ir;相应的蛋白标记物的分析包括如下步骤：4）、在载体酶标板或磁性纳米颗粒上负载包被抗体Ab2，并用封闭蛋白BSA进行孵化封闭，得到Ab2负载的载体材料S@Ab2；5）、在一定浓度的S@Ab2缓冲溶液中，加入待测蛋白AG，使待测蛋白AG与载体上的包被抗体Ab2特异性结合得到S
‑
Ab2@AG；6）、在S
‑
Ab2@AG中加入步骤3）得到的铱络合物标记纳米颗粒AuNPs
‑
Ab1@CD@Ir或AgNPs
‑
Ab1@CD@Ir或PS
‑
Ab1@CD@Ir或SiO2‑
Ab1@CD@Ir，实现铱络合物对待测蛋白AG的标记。
[0009]7）、向步骤6得到的标记材料中，加入含有氧化还原荧光探针和氢源（甲酸或甲酸钠或甲酸钾或甲酸铵或甲酸三乙胺或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐（还原型）NADH）的荧光检测液，在0
‑
100摄氏度温度，孵化反应0
‑
120分钟后，测试溶液的荧光强度变化，从而实现对待测蛋白AG的定量检测。
[0010]根据权利要求1所述的“一种基于环糊精
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金刚烷化铱络合物标记的疾病标记物荧光检测方法”中，其步骤1) 所述纳米颗粒均为单分散型纳米颗粒，直径为1 nm
‑
5000 nm，形貌包括球形或棒状或菱形。纳米材料包括金纳米颗粒（AuNPs）、银纳米颗粒（AgNPs）、聚苯乙烯微球（PS）或二氧化硅微球（SiO2），其中，聚苯乙烯微球和二氧化硅微球表面需包含氨基、羧基、环氧乙烷、N
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羟基琥珀酰亚胺等活性官能团。
[0011]根据权利要求1所述的“一种环糊精
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金刚烷化铱络合物主客体组装标记的蛋白标记物荧光检测方法”中，其特征在于：步骤3）所述的金刚烷功能化铱络合物，其结构中均包含有金刚烷官能团，能够与β
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环糊精形成牢固的主客体结本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于环糊精
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金刚烷化铱络合物主客体组装标记的蛋白标记物荧光检测方法，其特征在于, 环糊精
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金刚烷化铱络合物标记材料的制备步骤如下：1)以金纳米颗粒（AuNPs）、银纳米颗粒（AgNPs）、聚苯乙烯微球（PS）或二氧化硅微球（SiO2）为载体，首先与标记抗体Ab1以一定比例直接混合修饰或采用缩合剂(1
‑
乙基
‑
（3
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二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐EDCI、N
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羟基琥珀酰亚胺NHS)活化后偶联，得到Ab1标记的纳米材料AuNPs@Ab1或 AgNPs@Ab1或PS@Ab1或 SiO2@Ab1；2)将AuNPs@Ab1或 AgNPs@Ab1或PS@Ab1或 SiO2@Ab1进一步与巯基或双硫键或氨基功能化β
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环糊精混合振荡2到24小时，接着采用封闭剂胎牛血清蛋白（BSA）或脱脂奶粉或酪蛋白或吐温进行孵化封闭后得到环糊精功能化的Ab1标记的金纳米颗粒 AuNPs
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Ab1@CD或AgNPs
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Ab1@CD或PS
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Ab1@CD或SiO2‑
Ab1@CD；3)将AuNPs
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Ab1@CD或AgNPs
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Ab1@CD 或PS
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Ab1@CD或SiO2‑
Ab1@CD在金刚烷化铱络合物溶液中孵化1
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24小时，得到环糊精
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金刚烷主客体修饰的铱络合物标记纳米材料AuNPs
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Ab1@CD@Ir或AgNPs
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Ab1@CD@Ir或PS
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Ab1@CD@Ir或SiO2‑
Ab1@CD@Ir;相应的蛋白标记物的分析包括如下步骤：4)在载体酶标板或磁性纳米颗粒上负载包被抗体Ab2，并用封闭蛋白BSA进行孵化封闭，得到Ab2负载的载体材料S@Ab2；5)在一定浓度的S@Ab2缓冲溶液中，加入待测蛋白AG，使待测蛋白AG与载体上的包被抗体Ab2特异性结合得到S
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Ab2@AG；6)在S
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Ab2@AG中加入步骤3）得到的铱络合物标记纳米颗粒AuNPs
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Ab1@CD@Ir或AgNPs
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Ab1@CD@Ir或PS
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Ab1@CD@Ir或SiO2‑
Ab1@CD@Ir，实现铱络合物对待测蛋白AG的标记；7)向步骤6得到的标记材料中，加入含有氧化还原荧光探针和氢源（甲酸或甲酸钠或甲酸钾或甲酸铵或甲酸三乙胺或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐（还原型）NADH）的荧光检测液，在0
‑
100摄氏度温度，...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵立军，祁彩霞，张彩梅，
申请(专利权)人：烟台大学，
类型：发明
国别省市：