一种牛多杀性巴氏杆菌外膜囊泡及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种牛多杀性巴氏杆菌外膜囊泡，涉及疫苗制备技术领域，所述外膜囊泡为夹膜B群牛多杀性巴氏杆菌CVCC44502株分泌。本发明专利技术首次将多杀性巴氏杆菌外膜囊泡作为疫苗免疫动物，通过动物试验证明本发明专利技术多杀性巴氏杆菌外膜囊泡具有显著预防多杀性巴氏杆菌病的效果，可用于制备预防多杀性巴氏杆菌病的产品，从而应用于预防多杀性巴氏杆菌病、避免细菌耐药性，具备良好的实际应用价值。具备良好的实际应用价值。具备良好的实际应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种牛多杀性巴氏杆菌外膜囊泡及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及疫苗制备
，更具体的说是涉及一种牛多杀性巴氏杆菌外膜囊泡及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]外膜囊泡(OMVs)是革兰氏阴性菌表面分泌的产物，是细菌外膜在一定的机制下发生出芽并在细菌表面形成一种囊泡状的结构，这种结构包括了外膜以及周质成分。外膜囊泡大多数为球形，直径大约在20
–
250nm之间。1959年，De等首次发现霍乱弧菌滤除细菌后的培养液能够诱导家兔对霍乱弧菌的免疫反应。Chatterje等在研究对数生长期霍乱弧菌的超微结构时，发现在液体培养基无菌滤液中有革兰氏阴性菌细胞壁出芽形成的囊泡，而且在外膜容易发生囊泡出芽的位点附近，颗粒物质含量较高，这些颗粒可以随着细胞质进入出芽的囊泡中。OMVs的产生代表着细菌具有向外部环境释放大量的，复杂的蛋白组分和磷脂的独特机制。后来的研究发现，几乎所有的革兰氏阴性菌都能产生OMVs，其化学结构的组成成分除了外膜蛋白还有其他一些膜结构成分，所以人们将这种膜结构的囊泡称为外膜囊泡。
[0003]随着公共卫生的进步，细菌感染发生有所降低，但细菌感染仍然是导致人类生病和死亡的主要原因之一。由于耐药菌的增加和快速传播，抗生素治疗细菌性疾病的有效性受到了挑战。因此，疫苗被认为是后抗生素时代应对细菌性疾病最直接有效的策略。高效的疫苗必然具备三大因素，(1)抗原：能够触发免疫反应，产生免疫记防止机体受到进一步的攻击。(2)佐剂：保证免疫反应足够强大。(3)具一定的安全性。/>[0004]OMVs中包含的外膜组分可以刺激机体产生适应性免疫记忆，含有的LPS可作为自身佐剂，而且作为非复制性疫苗具一定安全性。所以这些因素促使OMVs成为开发非复制性高效疫苗的热门选择。
[0005]现有多杀性巴氏杆菌疫苗种类包括牛Pm灭活疫苗、牛Pm弱毒活疫苗、牛Pm亚单位疫苗。但灭活疫苗接种后不能在动物体内繁殖，因此使用时接种剂量较大，接种次数较多，免疫期较短，通常需要加入适当的佐剂以增强免疫效果。弱毒活疫苗运输和存储不方便，并且存在可能毒力返强的现象。亚单位疫苗免疫原性较低，需与佐剂合用才能产生好的免疫效果。
[0006]多杀性巴氏杆菌病的预防与诊疗是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，本专利技术提供了一种牛多杀性巴氏杆菌外膜囊泡及其制备方法与应用，本专利技术疫苗的产出旨在增强免疫效果，产生良好的交叉免疫性，提高动物保护率，避免细菌耐药性造成的细菌病难以控制的现状实现对牛多杀性巴氏杆菌病的有效预防。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0009]一种牛多杀性巴氏杆菌外膜囊泡，所述外膜囊泡为夹膜B群牛多杀性巴氏杆菌
CVCC44502株分泌。
[0010]作为优选的技术方案，所述外膜囊泡具有双层膜结构的囊泡状小体，携带细菌外膜和周质成分，包括酶、毒力因子、细菌特异性抗原和多种病原相关分子模式。
[0011]作为优选的技术方案，所述外膜囊泡粒径在200nm以内，蛋白条带大小集中在33KDa
‑
45 KDa之间。
[0012]本专利技术的另一目的是，提供上述牛多杀性巴氏杆菌外膜囊泡的制备方法，包括以下步骤：
[0013](1)将荚膜B群牛多杀性巴氏杆菌CVCC 44502株培养到稳定期，得到菌液；
[0014](2)将菌液10000rpm/min，4℃，离心10min，取上清过0.45μm滤膜；
[0015](3)将过滤后的上清经两次超高速离心，取沉淀经PBS重悬过0.22μm滤膜，得牛多杀性巴氏杆菌外膜囊泡。
[0016]作为优选的技术方案，步骤(1)所述培养条件为37
±
1℃，时间为18
‑
22h。
[0017]作为优选的技术方案，步骤(3)所述两次超高速离心具体为上清液超高速离心，42000rpm/min，4℃，离心2h，弃上清；用PBS缓冲液重悬沉淀，将重悬液进行第二次超高速离心，42000rpm/min，4℃，离心2h，弃上清。
[0018]本专利技术的又一目的是，提供一种预防多杀性巴氏杆菌病的疫苗，包括上述的牛多杀性巴氏杆菌外膜囊泡。
[0019]作为优选的技术方案，所述牛多杀性巴氏杆菌外膜囊泡的浓度为50μg/mL。
[0020]作为优选的技术方案，所述疫苗在
‑
80℃环境下冻存。
[0021]本专利技术的再一目地是，提供上述牛多杀性巴氏杆菌外膜囊泡在预防多杀性巴氏杆菌病中的应用。
[0022]本专利技术首次将多杀性巴氏杆菌外膜囊泡作为疫苗免疫动物，通过动物试验证明本专利技术多杀性巴氏杆菌外膜囊泡具有显著预防多杀性巴氏杆菌病的效果，可用于制备预防多杀性巴氏杆菌病的产品，从而应用于预防多杀性巴氏杆菌病、避免细菌耐药性，具备良好的实际应用价值。
附图说明
[0023]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0024]图1为荚膜B群牛多杀性巴氏杆菌CVCC44502的菌落特征；
[0025]图2为外膜囊泡OMVs提取示意图；
[0026]图3为CVCC44502的OMVs透射电镜图；
[0027]图4为蛋白浓度
‑
吸光度标准曲线图；
[0028]图5为多杀性巴氏杆菌液上清OMVs的蛋白SDS
‑
PAGE电泳图其中，1：20μL上样量；2：10μL上样量。
[0029]图6为白兔血清抗体滴度变化图。
具体实施方式
[0030]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本专利技术进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0031]根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本专利技术的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本专利技术的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本专利技术的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本专利技术实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
[0032]为了更好地理解本专利技术而不是限制本专利技术的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种牛多杀性巴氏杆菌外膜囊泡，其特征在于，所述外膜囊泡为夹膜B群牛多杀性巴氏杆菌CVCC44502株分泌。2.根据权利要求1所述的牛多杀性巴氏杆菌外膜囊泡，其特征在于，所述外膜囊泡具有双层膜结构的囊泡状小体，携带细菌外膜和周质成分，包括酶、毒力因子、细菌特异性抗原和多种病原相关分子模式。3.根据权利要求1所述的牛多杀性巴氏杆菌外膜囊泡，其特征在于，所述外膜囊泡粒径在200nm以内，蛋白条带大小集中在33KDa
‑
45 KDa之间。4.如权利要求1
‑
3任一所述牛多杀性巴氏杆菌外膜囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将荚膜B群牛多杀性巴氏杆菌CVCC 44502株培养到稳定期，得到菌液；(2)将菌液10000rpm/min，4℃，离心10min，取上清过0.45μm滤膜；(3)将过滤后的上清经两次超高速离心，取沉淀经PBS重悬过0.22μm滤膜，得牛多杀性巴氏杆菌外膜囊泡。5.根据权利要求4所述的制...

【专利技术属性】
技术研发人员：李劼，高洁，刘文香，李化生，张立华，张慧，穆杨，
申请(专利权)人：金宇保灵生物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：