一种固定化酶及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种固定化酶，包含疏水载体、脂肪酶、纳米碳酸钙和包被在最外层的多巴胺；所述脂肪酶与载体的质量比为1:100

【技术实现步骤摘要】
一种固定化酶及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及酶工程领域，尤其涉及一种固定化酶及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]脂肪酸单甘酯是一种典型的W/O型活性剂，被广泛应用于食品、医药、塑料等行业。目前工业上大规模生产单甘酯的主流方法是化学法，主要包括酯化法、酯交换法和基团保护法等，化学法常使用腐蚀性强的酸碱催化剂或有机溶剂，且多在高温条件下进行，能耗高，产品质量差，易造成环境问题。而生物酶活，条件温和，可以避免传统化学法的缺点，因此受到广泛关注。
[0003]生物酶法是采用生物脂肪酶作为催化剂来实现单甘酯的合成，主要包括酶法水解、醇解、甘油解和酶法酯化。利用脂肪酸及其酯与甘油进行酶法酯化是研究较多的方法之一。该方法的主要挑战是甘油和脂肪酸两种底物的极性差别大，互不溶解，在反应体系中常需要借助溶剂提高分散(Biotechnology Letters，2003，25：641－644)。加入溶剂虽有助于底物和酶的接触，但会给后续操作带来麻烦。研究无溶剂体系中酶法甘油酯化制备单甘酯有利于简化反应操作，降低生产成本。
[0004]在无溶剂体系中，提高反应产物中单甘酯的含量通常需要较高的甘油和月桂酸分子比例(4:1)，例如Amin和Wael等(Journal of Cleaner Production，2016，137，953
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964)研究了无溶剂条件下固定化脂肪酶RM
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IM催化的甘油和月桂酸酯化反应，经优化反应参数发现在60oC,4％加酶量、甘油与脂肪酸摩尔比4:1的条件下，较短的反应时间内(1h)月桂酸转化率可达到93％，且反应产物中单甘酯的含量最高达到50％。
[0005]专利CN 106995827 A以固定化酶Novozyms 435为催化剂考察了离子液体系中酶法合成单甘酯，发现[Tf2N]‑
型离子液体系对单甘酯合成具有最好的选择性。甚至在甘油与脂肪酸摩尔比1:1的条件下，通过对离子液体性质的研究和优化，油脂产物中单甘酯的含量可达到60％左右。但离子液体的添加大大降低了脂肪酸的转化速率，使反应时间长达8h,，固定化酶的催化效率较低。
[0006]总之在酶法合成单甘酯领域，使用的催化剂主要是商品化的Lypozyme RM
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IM或Novozyms 435，产物中存在单甘酯，甘二酯和甘三酯，且单甘酯的含量只有50％左右，剩下将近一半的反应产物须通过相应后处理分离，大大增加了单甘酯的生产成本。而且底物中甘油和月桂酸的比例也较高，反应结束后产物中存在大量未反应的甘油。因此在本领域仍然需要开发能够高选择性地制备单甘酯，同时减少甘二酯和甘三酯生成量的酶制剂或者开发新的固定化酶技术改善已有酶制剂对酯化反应的选择性，以降低酶法生产单脂肪酸甘油酯的生产成本。

技术实现思路

[0007]本专利技术第一方面的目的在于提供一种固定化酶，其包含疏水载体、脂肪酶、纳米碳酸钙和包被在最外层的多巴胺；所述脂肪酶与载体的质量比为1:100
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1:20；所述纳米碳酸
钙的粒径小于表面疏水的多孔载体的孔径。
[0008]优选地，所述疏水载体质量占比为70
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80％，更优选75％；
[0009]优选地，所述脂肪酶质量占比为1.5％
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8％，更优选3.5
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8％；
[0010]优选地，所述碳酸钙质量占比为1％
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4％，更优选2.5
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3％；
[0011]优选地，所述多巴胺质量占比为0.01％
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1％，更优选0.25
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0.5％。
[0012]本专利技术所述的纳米碳酸钙，其作用并不像传统的造粒固定化酶作为载体使用。在本专利技术中，所述纳米碳酸钙通过浸渍的步骤作用于吸附脂肪酶的疏水载体，因其粒径小于所述疏水载体的步骤，因此所述纳米碳酸钙部分可附着在疏水载体的外表面，部分可进入疏水载体的孔道分布在脂肪酶的周围。推测，可能是因纳米碳酸钙的弱碱性或其自身的某些特性，导致其可能与脂肪酶发生一些微妙的反应或者对脂肪酶的结构产生一些影响，从而导致本专利技术所述的固定化酶在催化甘油和脂肪酸进行酯化反应时，有效抑制了甘油三酯和甘油二酯产物的生成，大大提高了油脂产物中单甘酯的含量。本专利技术所述的纳米碳酸钙容易脱离脂肪酶或疏水载体，因此本专利技术将多巴胺包被在固定化酶的最外侧，避免了纳米碳酸钙的流失，同时多巴胺也可以改善疏水载体的表面性质，从而使固定化酶具有较好的循环稳定性。
[0013]在某些实施方案中，所述固定化酶中使用的疏水载体为表面包含长链烷基的多孔载体，优选为大孔吸附树脂，更优选为表面分布C4
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C20烷烃的大孔吸附树脂。所述载体可以选自漂莱特公司的ECR8806M,ECR8806F，ECR8804M,ECR8804F，或蓝晓科技新材料公司的LX
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201A。
[0014]在某些实施方案中，所述固定化酶中的脂肪酶为用于油脂分解的微生物来源的脂肪酶；优选地，所述脂肪酶选自疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、米根霉(Rhizopus oryzae)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、黑曲霉(Aspergillus niger)或以上微生物的基因改造菌种中的至少一种。
[0015]本专利技术第二方面的目的在于提供一种固定化酶的制备方法，包括以下步骤：
[0016](1)脂肪酶溶液和疏水载体接触；
[0017](2)将吸附脂肪酶的载体滤出，放入纳米碳酸钙乳化液中浸渍；
[0018](3)将浸渍后的载体过滤后低温冷却，置于多巴胺溶液中振荡；
[0019](4)振荡结束后过滤除去液体，剩余物经干燥即得到所述固定化酶。
[0020]在某些实施方案中，步骤(1)中所述疏水载体为表面包含长链烷基的多孔载体，优选为大孔吸附树脂，更优选为表面分布C4
‑
C20烷烃的大孔吸附树脂。
[0021]在某些实施方案中，步骤(1)中所述脂肪酶为用于油脂分解的微生物来源的脂肪酶；优选地，所述脂肪酶选自疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、米根霉(Rhizopus oryzae)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、黑曲霉(Aspergillus niger)或以上微生物的基因改造菌种中的至少一种。
[0022]在某些实施方案中，步骤(1)中脂肪酶溶液的浓度为1
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30mg/ml，分散在10
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20mM的磷酸盐缓冲液中。
[0023]在某些实施方案中，步骤(1)中中脂肪酶与疏水载体的质量比本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种固定化酶，其特征在于，包含疏水载体、脂肪酶、纳米碳酸钙和包被在最外层的多巴胺；所述脂肪酶与载体的质量比为1:100
‑
1:20；所述纳米碳酸钙的粒径小于所述疏水载体的孔径。2.如权利要求1所述的固定化酶，其特征在于，所述疏水载体为表面包含长链烷基的多孔载体，优选地，所述载体为表面分布C4
‑
C20烷烃的大孔吸附树脂，选自漂莱特公司的ECR8806M、ECR8806F、ECR8804M、ECR8804F或蓝晓科技新材料公司的LX
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201A。3.如权利要求1或2所述的固定化酶，其特征在于，所述脂肪酶为用于油脂分解的微生物来源的脂肪酶；优选地，所述脂肪酶选自疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、米根霉(Rhizopus oryzae)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、黑曲霉(Aspergillus niger)或以上微生物的基因改造菌种中的至少一种。4.一种固定化酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)脂肪酶溶液和疏水载体接触；(2)将吸附脂肪酶的载体滤出，放入纳米碳酸钙乳化液中浸渍；(3)将浸渍后的载体过滤后低温冷却，置于多巴胺溶液中振荡；(4)振荡结束后过滤除去液体，剩余物经干燥即得到所述固定化酶。5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述疏水载体为表面包含长链烷基的多孔载体，优选为大孔吸附树脂，更优选为表面分布C4
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C20烷烃的大孔吸附树脂；和/或步骤(1)中所述脂肪酶为用于油脂分解的微生物来源的脂肪酶，优选地，所述脂肪酶选自疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、米根霉(Rhizopus oryzae)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、黑曲霉(Aspergillus niger)或以上微生物的基因改造菌种中的至少一种；和/或步骤(1)中脂肪酶溶液的浓度为1
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3...

【专利技术属性】
技术研发人员：金倩茹，付官文，
申请(专利权)人：丰益上海生物技术研发中心有限公司，
类型：发明
国别省市：