一种脂肪酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术属于酶工程技术领域，具体涉及一种脂肪酶突变体及其应用。所述脂肪酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述脂肪酶突变体在制备三氯蔗糖中的应用具体为：以八乙酰基蔗糖为原料，在碱性蛋白酶E及脂肪酶突变体作用下，选择性脱除4,1

【技术实现步骤摘要】
一种脂肪酶突变体及其应用


[0001]本专利技术属于酶工程
，具体涉及一种脂肪酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]近年来，三氯蔗糖作为一种应用广泛、附加值高的食品添加剂受到广泛的关注。其化学名为4,1',6'
‑
三氯
‑
4,1',6'
‑
三脱氧半乳型蔗糖，是一种白色粉末状产品，极易溶于水、乙醇和甲醇。其甜度为蔗糖的600倍左右，且甜味纯正，同时具有安全性高、稳定性好等特点。三氯蔗糖是由英国Tate&Lyie公司于1976年开发的一种蔗糖氯化衍生物，目前其合成方法主要分为下几种：
[0003](1)全基团保护法：以蔗糖为原料，首先，通过一步反应利用两种保护基保护蔗糖上的全部羟基，三苯甲基保护蔗糖6,1',6'
‑
位三个伯位羟基，乙酰基保护剩余的仲位羟基；第二步，选择性脱除三苯甲基保护基得到五乙酰基蔗糖；再经4,6
‑
位乙酰基迁移，制得重要中间体4,1',6'
‑
三羟基五乙酰基蔗糖；之后，经过氯化、脱乙酰基保护得到三氯蔗糖，总收率约30％。本方法工艺流程复杂，所涉及的反应步骤较多，在工业生产过程中，无疑会增加生产成本及废液的排放量。全基团保护法制备三氯蔗糖的合成路线如下：
[0004][0005](2)单酯法：以蔗糖为原料，利用化学方法选择性的对蔗糖6
‑
位伯羟基进行单酯化，即得蔗糖
‑6‑
酯，再用适当的氯化剂进行选择性氯化制备三氯蔗糖
‑6‑
酯，最后脱除6
‑
位酯基制得三氯蔗糖，总收率约30％
‑
40％。本方法虽然缩短了三氯蔗糖的合成步骤，但同样存在一些缺点。例如，在氯化反应过程中，由于氯化反应缺少选择性会造成多种氯代副产物杂质的生成，给后续纯化步骤造成巨大困难。保护法制备三氯蔗糖的合成路线如下：
[0006][0007](3)棉子糖法：以棉子糖为原料，棉子糖在三苯基氧膦或亚硫酰氯的作用下，经氯代生成4,1',6',6
”‑
四氯
‑
4,1',6',6
”‑
四脱氧半乳型棉子糖，最后在酶作用下，水解生成三氯蔗糖，总收率约27％。本方法原料棉子糖来源较为困难，一般需从半乳糖和蔗糖水溶液中合成，生产成本较高。棉籽糖法制备三氯蔗糖的合成路线如下：
[0008][0009]在以上这些工作基础上，本专利技术开发一种酶法
‑
化学法联合制备三氯蔗糖的高效方法，以全乙酰蔗糖为原料，碱性蛋白酶E及脂肪酶突变体LIP
‑
GX作用下，以较高的收率得到4,1',6'
‑
三羟基
‑
五乙酰基蔗糖中间体，后经常规的化学氯代法以及水解法脱除其余乙酰保护基制备三氯蔗糖。
[0010]该方法与已报道的方法(全基团保护法或单酯法)相比，反应类型比较简单易操作，氯代反应位点更加专一，副反应及多氯代杂质较少，容易操作纯化。另外，酶法联合化学法可大大减少废液排放，比较符合当前环保要求，适用于工业生产。

技术实现思路

[0011]在本文中，术语“突变体”可理解为包含至少一个野生型或天然氨基酸被不同于野生型或天然多肽的氨基酸取代的突变型多肽。突变体可以只包含一个野生型或天然氨基酸取代，称为“点突变”或“单点突变”多肽。另外，突变体可包含两个或更多个野生型或天然氨基酸被不同于野生型或天然多肽的两个或多个氨基酸取代。
[0012]取代突变可利用本领域熟知的任何诱变技术制备，包括但不限于定点诱变。其中，定点诱变是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目的DNA片段(可以是基因组，也可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化)，包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的形状及表征。
[0013]本专利技术中，术语“表达载体”是指包含适当的调控序列，例如启动子、终止子、增强子等的本领域的常规表达载体。
[0014]本专利技术中，术语“氨基酸”：包含天然氨基酸、合成氨基酸、以及以类似于天然氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸在本文中可以由其通常已知的三字母符号或由IUPAC
‑
IUB生物化学命名法委员会(Biochemical Nomenclature Commission)所推荐的单字母符号来提及。
[0015]本专利技术中的脂肪酶突变体的构建，是通过定向进化的技术手段得到的。具体为，利用易错PCR、DNA重排、半理性设计及三维结构模拟等定向进行技术来获得突变体。更为具体的是，本专利技术通过三维结构模拟技术来进行酶的定向进化。采用同源建模的方法，利用能量最低原理和分子对接技术预测出可能的与催化相关的一个或多个位点，然后对这些位点进
行定点饱和定点突变，从中筛选出活性有显著提高的突变体。
[0016]本专利技术中，术语“氨基酸序列”是氨基酸相互连接形成肽链(或多肽)的顺序。
[0017]本专利技术中，术语“重组质粒”指的是目的基因和载体结合后的产物。
[0018]本专利技术中，术语“宿主细胞”为本领域常规的各种宿主细胞，只要能使载体稳定地自行复制，且所携带的核酸分子可被有效表达即可。其中所述宿主细胞是真核表达细胞。
[0019]本专利技术中，术语表达盒：是指能够在宿主细胞(如微生物细胞、植物细胞)中表达所述蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动所述蛋白质基因转录的启动子，还可包括终止所述蛋白质基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
[0020]本专利技术中，术语一致性：指核酸序列间的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
[0021]本专利技术的目的是提供一种脂肪酶突变体及其应用。
[0022]一方面，本专利技术提供了一种脂肪酶突变体LIP
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GX，所述脂肪酶突变体LIP
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GX的序列为：
[0023](1)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或
[0024](2)与序列SEQ ID NO.1限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或
[0025](3)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的由(1)衍生的蛋白。
[0026]优选地，用于表达所述脂肪酶突变体LIP
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GX的表达载体包括但不限于pPIC9K，pPIC3.5K，pPICZα、pPICZ、pET22b、pMA5。
[0027]优选地，用于所述表达载体转化的宿主细胞为真菌或细菌。
[0028]进一步优选地，用于本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种脂肪酶突变体LIP
‑
GX，其特征在于，所述脂肪酶突变体LIP
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GX的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种编码权利要求1所述的脂肪酶突变体LIP
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GX的基因，其特征在于，所述脂肪酶突变体LIP
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GX基因序列如SEQ ID NO.2所示。3.权利要求1中所述的脂肪酶突变体LIP
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GX或权利要求2所述的基因在制备三氯蔗糖中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，脂肪酶突变体LIP
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GX和碱性蛋白酶E共同作用制备三氯蔗糖，反应步骤如下：以八乙酰基蔗糖作为底物，反应体系中加入碱性蛋白酶E和脂肪酶突变体LIP
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GX催化反应，得到4,1
’
,6
’‑
三羟基
‑
五乙酰基蔗糖，后经化学氯代法以及水解法脱除乙酰基制备三氯蔗糖；所述碱性蛋白酶E的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述反应体系包括N,N
...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨登峰，李红亮，潘丽霞，李娟，张秀，阳丽艳，黄艳冰，
申请(专利权)人：广西科学院，
类型：发明
国别省市：