一种生物样本中γ-氨基丁酸转氨酶活性测定方法技术

本发明专利技术公开一种生物样本中γ

【技术实现步骤摘要】
一种生物样本中
γ
‑
氨基丁酸转氨酶活性测定方法


[0001]本专利技术涉及生物检测分析
，尤其涉及一种生物样本中γ
‑
氨基丁酸转氨酶活性测定方法。

技术介绍

[0002]γ
‑
氨基丁酸(GABA)是哺乳动物中枢神经系统内的主要抑制性递质，约50％的中枢突触部位以其作为递质，主要通过与GABA
‑
A、GABA
‑
B、GABA
‑
C受体结合发挥重要的生理活性。GABA的降解主要由GABA转氨酶催化，脱氨基生成琥珀酸半醛，再经琥珀酸半醛脱氢酶催化生成琥珀酸，进入三羧酸循环。增加脑内GABA浓度可以提高GABA能系统的神经抑制作用，进而用于治疗如癫痫、帕金森病、亨廷顿舞蹈症、Alzheimer病等。γ
‑
氨基丁酸转氨酶(GABA
‑
T)是催化GABA分解代谢的关键酶，其活力高低直接影响到神经递质GABA的水平，因此在对于疾病进行诊断或是相关中枢神经系统药物的开发过程中，生物样本中的γ
‑
氨基丁酸转氨酶活性的测定是非常重要的。目前对于γ
‑
氨基丁酸转氨酶活性的检测主流是采用ELISA法，但此方法会受到样本来源及其种属的限制，通用性不理想，且检测过程中，需要使用抗体等昂贵试剂，检测价格较高。

技术实现思路

[0003]因此，基于以上背景，本专利技术提供一种生物样本中γ
‑
氨基丁酸转氨酶活性测定方法，其生物样本不受来源及其种属的限定，通用性较好，且无需使用抗体等昂贵试剂，检测成本低，且操作方便。
[0004]本专利技术的技术方案如下：
[0005]一种生物样本中γ
‑
氨基丁酸转氨酶活性测定方法，其包括如下步骤：
[0006]S1：配制测定溶液
[0007]所述溶液包括GABA
‑
T抑制剂溶液、检测缓冲液、细胞裂解缓冲液、NADH系列标准溶液、GABA溶液；
[0008]S2：绘制标准曲线
[0009]测定340nm处的NADH系列标准溶液的OD值，绘制标准曲线，且得到回归方程；
[0010]S3：生物样本前处理
[0011]所述生物样本为血液时：取血后，室温静置，离心得血清，待检测即可；
[0012]所述生物样本为细胞/组织样本时：将生物样本加入细胞裂解缓冲液冰上匀浆，离心后将细胞/组织裂解液浓度调整一致，待检测即可；
[0013]S4：GABA
‑
T活性的测定
[0014]将步骤S3处理后的生物样本、检测缓冲液、GABA
‑
T抑制剂溶液加入UV板中后，震荡混匀后，立即向各反应孔中加入GABA溶液，室温避光孵育，在反应的第0和30min测定340nm处每个孔的OD值；
[0015]所述生物样本、检测缓冲液、GABA
‑
T抑制剂溶液加入时，分为三行加入，其中第一
行中分别加入有GABA
‑
T抑制剂溶液、生物样本、检测缓冲液，第二行中分别加入有生物样本、检测缓冲液，第三行中分别加入有生物样本、检测缓冲液；
[0016]S5：检测结果处理
[0017]用第二、三行的所测量的OD均值减去第一行的OD值，即得每个生物样本中产物的OD绝对值；
[0018]然后代入步骤S2所得的NADH标准曲线中即可算出每个生物样本在30min内NADH的产生量，该值和GABA
‑
T的活性呈正比。
[0019]进一步地，步骤S1中细胞裂解缓冲液包括TritonX
‑
100、GSH、PLP、Na2EDTA、K2HPO4/KH2PO4。
[0020]进一步地，所述GABAT抑制剂溶液为50mM的氨己烯酸水溶液。
[0021]进一步地，所述NADH系列标准溶液的浓度分别为31.25μM、62.5μM、125μM、250μM、500μM。
[0022]进一步地，步骤S1中检测缓冲液包括K4P2O7、AKG、NAD
+
、DTT、PLP。
[0023]进一步地，步骤S4中所述UV板为96孔UV板。
[0024]采用本专利技术实现的有益效果为：
[0025]本专利技术依据GABA
‑
T酶促反应的原理，以相同时间内NADH的生成量反映GABA
‑
T的活性，通过引入GABA
‑
T抑制剂作为参比孔，用检测孔和参比孔的差值反应NADH的变化，能够很好地消除检测本底漂移、待测样本颜色对检测结果的影响。相比于目前主流的ELISA方法，本专利技术所测生物样本不受来源及种属的限制，通用性好，且无需使用抗体等昂贵试剂，价格低廉，操作简便，是一种经济、简便、稳定、准确的检测方法。
附图说明
[0026]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0027]图1为本专利技术的测定的简单工艺流程图；
[0028]图2为本专利技术实施例的标准曲线图；
[0029]图3为本专利技术实施例的GABA
‑
T过表达小鼠的验证结果，其中图3a为Westen Blot法检测心肌组织GABA
‑
T的蛋白水平；图b为采用本专利技术标准曲线法检测心肌组织GABA
‑
T的活性。n＝10
‑
11，*P＜0.05vs.野生型。
具体实施方式
[0030]现将详细地提供本专利技术实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本专利技术。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本专利技术进行多种修改和变化而不背离本专利技术的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
[0031]因此，旨在本专利技术覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本专利技术的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普
通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本专利技术更广阔的方面。下面结合实施例对本专利技术做进一步说明。
[0032]本专利技术一种生物样本中γ
‑
氨基丁酸转氨酶活性测定方法，其包括如下步骤：
[0033]S1：配制测定溶液
[0034]所述溶液包括GABA
‑
T抑制剂溶液、检测缓冲液、细胞裂解缓冲液、NADH系列标准溶液、GABA溶液；
[0035]S2：绘制标准曲线
[0036]测定340nm处的NADH系列标准溶液的OD值，绘制标本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物样本中γ
‑
氨基丁酸转氨酶活性测定方法，其特征在于，其包括如下步骤：S1：配制测定溶液所述溶液包括GABA
‑
T抑制剂溶液、检测缓冲液、细胞裂解缓冲液、NADH系列标准溶液、GABA溶液；S2：绘制标准曲线测定340nm处的NADH系列标准溶液的OD值，绘制标准曲线，且得到回归方程；S3：生物样品前处理所述生物样本为血液时：取血后，室温静置，离心得血清，待检测即可；所述生物样本为细胞/组织样本时：将生物样本加入细胞裂解缓冲液冰上匀浆，离心后将细胞/组织裂解液浓度调整一致，待检测即可；S4：GABAT活性的测定将步骤S3处理后的生物样本、检测缓冲液、GABAT抑制剂溶液加入UV板中后，震荡混匀后，立即向各反应孔中加入GABA溶液，室温避光孵育，在反应的第0和30min测定340nm处每个孔的OD值；所述生物样本、检测缓冲液、GABAT抑制剂溶液加入时，分为三行加入，其中第一行中分别加入有GABAT抑制剂溶液、生物样本、检测缓冲液，第二行中分别加入有生物样本、检测缓冲液，第三行中分别加入有生物样本、检测缓冲液；S5：检测结果处理用第二、三行的所测量的OD均值减去第一行的OD值，即得每个样品中产物的OD绝对值；然后代入步骤S2所得的N...

【专利技术属性】
技术研发人员：张梦晓，
申请(专利权)人：蚌埠医学院，
类型：发明
国别省市：