一种可常温保存的灭活型病毒保存液制造技术

本发明专利技术公开了一种可常温保存的灭活型病毒保存液，本发明专利技术涉及灭活型病毒保存液技术领域，包括以下步骤：S1：通过口咽拭子、鼻咽拭子以及血清采集的方法进行病毒采样，且口咽拭子通过用压舌板固定舌头，用口咽拭子越过舌根到咽后壁及扁桃体隐窝、侧壁等处，并且鼻咽拭子用拭子或者其他工具好鼻孔到耳根的距离并以手指作为标记，血清采集通过对患者进行血样抽集。该可常温保存的灭活型病毒保存液，首先将生长状态良好的HEK293T细胞消化计数后稀释至1

【技术实现步骤摘要】
一种可常温保存的灭活型病毒保存液


[0001]本专利技术涉及灭活型病毒保存液
，具体为一种可常温保存的灭活型病毒保存液。

技术介绍

[0002]病原体样本保存液是一种保护病毒活性或核酸稳定存在的液体，它主要适用于新型冠状病毒、手足口病毒、流感病毒等常见的病毒样本采集保存运输工作，可以用来采集咽拭子、鼻拭子或者特定部位的组织样本，储存的样本可以用于后续的核酸检测或者病毒培养等临床实验，
[0003]病毒样品在采集之后，通常都不能在采集样品处马上进行PCR检测，而病毒本身在体外很快就会裂解掉，如何能使病毒样品保持完整，又失去感染性，还易于保存运输，在保存及运输时加入维持检测稳定性的病毒样本保存液，就成了重中之重，
[0004]其中，灭活型病毒保存液，会使病毒蛋白的高级结构受到破坏，蛋白不再有生理活性，所以失去感染，致病和繁殖能力，但是常规的灭活不影响病毒蛋白的一级结构，意思就是病毒蛋白的序列没有变化，而灭活型保存液能在常温下保存相对较长的时间，节省了病毒样品保存以及运输的成本；
[0005]但是，现有的可常温保存的灭活型病毒保存液，在对病毒灭活过程中不便于对灭活型病毒保存液进行灭活效果的验证，进而不能提高灭活型病毒保存液的灭活效果，由此若灭活型病毒保存液灭活不彻底会降低其常温保存的效果，
[0006]于是，有鉴于此，针对现有的结构不足予以研究改良，提出一种可常温保存的灭活型病毒保存液。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种可常温保存的灭活型病毒保存液，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种可常温保存的灭活型病毒保存液，包括以下步骤：
[0009]S1：通过口咽拭子、鼻咽拭子以及血清采集的方法进行病毒采样，且口咽拭子通过用压舌板固定舌头，用口咽拭子越过舌根到咽后壁及扁桃体隐窝、侧壁等处，并且鼻咽拭子用拭子或者其他工具好鼻孔到耳根的距离并以手指作为标记，血清采集通过对患者进行血样抽集；
[0010]S2：通过不同的方法对采集到的病毒进行灭活处理，且针对口咽拭子和鼻咽拭子可以直接破坏RNA或破坏蛋白质的方法使其失活，并且针对血清可以通过人血白蛋白
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巴氏灭活或静注人免疫蛋白(PH4)
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巴氏灭活、低PH孵放的方法使其失活；
[0011]S3：进行病毒保存液灭活效果验证测试，且验证测试方法包括细胞培养
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病毒稀释
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病毒灭活
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终止灭活
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病毒孵育
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细胞培养
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荧光细胞观察与计数；
[0012]S4：灭活型病毒保存液中除了含有裂解的成分，通常还含有让蛋白变性破坏膜结构的去污剂、生物缓冲剂以及防止核酸酶降解核酸的抑制剂、还有维持核酸结构稳定的试剂，且裂解病毒的方法包括加热法和浓盐法；
[0013]S5：通过破坏RNA酶的分子结构，使样本中可能存在的核酸酶失活，起到稳定保存病毒样本的作用。
[0014]进一步的，根据S1所述口咽拭子需要反复擦拭3～5次，收集粘膜细胞，并轻取出拭子，避免触及舌头、悬垂体、口腔粘膜和唾液，且鼻咽拭子通过将拭子直至手指标记处或者是遇到阻力后停留数秒以吸取分泌物；(一般停留15
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30秒，然后轻轻旋转3次。
[0015]进一步的，根据S1所述血清采集把血液经过离心机进行离心处理，血细胞等就会沉淀在底部，上部清液就是血清，血清为淡黄色透明的液体。
[0016]进一步的，根据S2所述直接破坏RNA需要用到紫外灯、紫外线消毒柜、常见的消毒灯，具有253.7纳米波长的消毒进行灭菌用紫外灯，并且该紫外灯的紫外线(UV)可分为:UVA(紫外线a，波长320～400nm，长波)，UVB(波长280nm，320nm，中波)，UVC(波长100至280nm，短波)，且破坏蛋白质可通过物理加热、脱水和氧化的方法，并且物理加热主要采用的产品为蒸汽灭菌器，脱水主要采用的产品为医用酒精，氧化主要采用的产品为含氯消毒剂。
[0017]进一步的，所述根据S2所述人血白蛋白
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巴氏灭活步骤为组分V精制及超滤后进行，且调制要求:按每1g蛋白质加入0.115Q180mol主酸钠，按成虽规格以注射用水秘释至规定的蛋白质含量，并控制氯化钠含量不超过160mmo1/L，pH值为6.60～7.20，参数:60士0.5C、10小时。
[0018]进一步的，所述根据S2所述静注人免疫蛋白(PH4)
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巴氏灭活步骤为组分II沉淀(可以合并批次)溶解后，经澄清过滤、透析脱醇后，且调制要求:调整制品蛋白质含量为20士5g/L，加入甘氨酸至终含量为100+30g/L，调整制品pH至7.10～7.50，参数:60士0.5C、10小时，并且低PH孵放步骤为分装完成后，参数:23～25C至少21天。
[0019]进一步的，所述根据S3所述终止灭活采用病毒分离培养基(可用DMEM完全培养基替代)进行1000倍稀释以中和灭活保存液，终止灭活，且阴性对照为病毒分离培养基对灭活款病毒保存液稀释1000倍的混合液；并且阳性对照为病毒分离培养基对病毒原液稀释1000倍的混合液。
[0020]进一步的，根据S4所述浓盐法是用高浓度的盐可以破坏核酸与蛋白质之间的次级键，使核蛋白解联从而把病毒核酸释放出来，浓盐法中同时含有Rnase抑制剂，保护病毒核酸不被降解，保证后续能正常通过荧光
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PCR进行检测。
[0021]进一步的，根据S4所述加热法需要通过加热到80℃～100℃的温度值基础上，且不需要任何离心、抽提等操作步骤，加热法比常用的CheleX100提取方法和苯酚/氯仿等方法要快。
[0022]进一步的，根据S5所述破坏RNA酶的分子结构主要通过胍盐，胍盐是异硫氰酸胍、盐酸胍，无RNA酶和DNA酶活性。
[0023]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0024]1.本专利技术首先将生长状态良好的HEK293T细胞消化计数后稀释至1
×
104/mL，按照100μL/孔的体积，每个梯度的病毒做三个复孔，计算所需接种孔数，将细胞缓慢均匀接种至96孔板中放入37℃，5％CO2培养箱中培养过液，再将病毒滴度为107
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108TU/mL的病毒按10
倍梯度进行稀释，连续稀释3个梯度，接着把稀释好的病毒置于室温条件下，与灭活款病毒保存液按1:1体积比进行混合，置于室温下分别放置1min、5min和10min进行灭活，其中采用病毒分离培养基(可用DMEM完全培养基替代)进行1000倍稀释以中和灭活保存液，终止灭活，之后将事先培养的HEK293T细胞中吸弃细胞培养基，每孔加入100μL准备好的病毒混合液，和对应的阳性对照、阴性对照。病毒孵育3小时，每隔30分钟从培养箱中取出晃动一次，当孵育结束后，将病毒液吸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可常温保存的灭活型病毒保存液，包括以下步骤：S1：通过口咽拭子、鼻咽拭子以及血清采集的方法进行病毒采样，且口咽拭子通过用压舌板固定舌头，用口咽拭子越过舌根到咽后壁及扁桃体隐窝、侧壁等处，并且鼻咽拭子用拭子或者其他工具好鼻孔到耳根的距离并以手指作为标记，血清采集通过对患者进行血样抽集；S2：通过不同的方法对采集到的病毒进行灭活处理，且针对口咽拭子和鼻咽拭子可以直接破坏RNA或破坏蛋白质的方法使其失活，并且针对血清可以通过人血白蛋白
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巴氏灭活或静注人免疫蛋白(PH4)
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巴氏灭活、低PH孵放的方法使其失活；S3：进行病毒保存液灭活效果验证测试，且验证测试方法包括细胞培养
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病毒稀释
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病毒灭活
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终止灭活
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病毒孵育
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细胞培养
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荧光细胞观察与计数；S4：灭活型病毒保存液中除了含有裂解的成分，通常还含有让蛋白变性破坏膜结构的去污剂、生物缓冲剂以及防止核酸酶降解核酸的抑制剂、还有维持核酸结构稳定的试剂，且裂解病毒的方法包括加热法和浓盐法；S5：通过破坏RNA酶的分子结构，使样本中可能存在的核酸酶失活，起到稳定保存病毒样本的作用。2.根据权利要求1所述的一种可常温保存的灭活型病毒保存液，其特征在于，根据S1所述口咽拭子需要反复擦拭3～5次，收集粘膜细胞，并轻取出拭子，避免触及舌头、悬垂体、口腔粘膜和唾液，且鼻咽拭子通过将拭子直至手指标记处或者是遇到阻力后停留数秒以吸取分泌物；(一般停留15
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30秒，然后轻轻旋转3次。3.根据权利要求1所述的一种可常温保存的灭活型病毒保存液，其特征在于，根据S1所述血清采集把血液经过离心机进行离心处理，血细胞等就会沉淀在底部，上部清液就是血清。4.根据权利要求1所述的一种可常温保存的灭活型病毒保存液，其特征在于，根据S2所述直接破坏RNA需要用到紫外灯、紫外线消毒柜、常见的消毒灯，且...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘召宏，
申请(专利权)人：南京健邦锦源医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：